Hidrológiai Közlöny, 2013 (93. évfolyam)
2013 / 5-6. különszám - LIV. Hidrobiológus Napok előadásai
55 Szezonális és térbeli változások vizsgálata a Hévízi-tó planktonikus baktériumközösségeiben Krett Gergely, Jáger Katalin, Makk Judit, Márialigeti Károly, Borsodi Andrea ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C Kivonat: A Hévízi-tó természetes állapotának fenntartásáért és a gyógyhatásért a forráskráterből feláramló ásványi anyagok, a sajátos összetételű üledék, valamint a vízben és az üledékben élő baktériumközösségek anyagcseretermékei is jelentős szerepet játszanak. Jelen kutatásunk célja a még alig ismert planktonikus bakteriális diverzitás térbeli és időbeli változékonyságának feltérképezése volt tenyésztésen alapuló, illetve attól független, Denaturáló Gradiens Gél Elektroforézis (DGGE) és klónkönyvtár alapú molekuláris biológiai módszerekkel. A teljes bakteriális, illetve a cianobaktérium közösség szezonális és horizontális változásainak nyomon követésére a 2010 és a 2011 áprilisában, júliusában és októberében vett vízmintákat DGGE analízisnek vetettük alá. A 2011 áprilisából és októberéből származó kompozit vízmintákból szelektív táptalajok felhasználásával törzsgyűjteményt, valamint 16S rDNS alapú klónkönyv- tárat hoztunk létre. Az egyes minták DGGE sávmintázatai alapján a baktériumközösségek szerkezetében szezonális változások voltak megfigyelhetők. A domináns DGGE csíkok bázissorrend elemzését követően azok az a- és ß- Proteobacteria osztályok, valamint a Cyanobacteria és a Chloroflexi törzs képviselőiként voltak azonosíthatók. A reprezentatív kiónok szekvenciái túlnyomórészt szintén az a- és ß-Proteobacteria osztályokba voltak sorolhatóak, míg a törzsgyűjteményt az a-Proteobacteria osztály képviselői dominálták, de jelentős arányban fordultak elő a Bacteroidetes, az Actinobacteria törzs, valamint a y-Proteobacteria osztály képviselői is. Kulcsszavak: Hévízi-tó, tenyésztés, DGGE, klónozás, filogenetikai diverzitás Bevezetés A Hévízi-tó gyógyhatású vize két eltérő hőmérsékletű (egy 26°C-os és egy 41°C-os) forrásból táplálkozik. A tó vizének hőmérséklete a nyár nagy részében 33-35°C körüli, míg ősszel és télen az időjárástól függően alacsonyabb, de sajátos hőszabályozó mechanizmusának köszönhetően nem csökken 22°C alá. A tóvíz kalcium-magnézium-hidrokarbo- nát típusú. A kalcium és a magnézium a tó alatt található dolomit-rétegekből származik. A kálium, a szilícium és a lítium tartalom, valamint a jelentékeny rádium emanáció valószínűleg a triász rétegek alatt fekvő permi kőzetek mélységéből kerül a feltörő vízbe. A tóvízben jelenlévő kénvegyületek egyik része a lápnövényzetből eredeztethető, és állandóan pótlódik, másik része a mélyből tör fel. A vízben oldott szén-dioxid, azaz szénsav, a vulkáni utóműködés u- tolsó szakaszára jellemző ("savanyúvizes források"). Az említetteken kívül még a metán fontos alkotórésze a közel semleges kémhatású (pH 7,16) víznek (Schulhof 1957). A sajátos kemizmusú Hévízi-tó vizében előforduló baktériumközösségek összetételéről és szerkezetének alakulásáról ezidáig kevés ismerettel rendelkezünk (Clemente, 1982; Clemente és Szabó, 1982; Reskóné, 2002). Jelen kutatásunk során ezért a Hévízi-tó planktonikus baktériumközösségének időbeni és térbeli változását, továbbá a tóvízben előforduló baktériumközösségek filogenetikai diverzitását vizsgálatuk tenyésztésen alapuló illetve attól független molekuláris biológiai módszerek segítségével. Vizsgálati anyag és módszerek Vizsgálatainkhoz a vízmintákat 2010 és 2011 áprilisában, júliusában és októberében a tó 8 különböző pontjáról a vízfelszíntől 1 méteres vízmélységből gyűjtöttük. A te- nyésztéses eljárás során a 2011. áprilisi és októberi kompozit mintákból steril víz segítségével tízes alapú hígítási sort készítettünk és három féle táptalajra (R2A, PYE és Nutrient) szélesztettünk. Ezután a különálló telepek izolálásával törzsgyűjteményt hoztunk létre. A tenyésztéstől független módszerek esetében a vízmintákból először 100 ml-nyi mennyiséget 45 pm pórusátmérőjű szűrőn átszűrtük, majd Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit (Mo-Bio, Carlsbad, CA, USA) segítségével a gyártó útmutatásai szerint izoláltuk a közösségi DNS-t. A 2011. áprilisi és októberi mintákból a 16S rRNS gén vizsgálatán alapuló klónkönyvtárakat hoztunk létre (pGEM-T Vector System, Promega, Madison, Wisconsin, USA) 27f és 1401r primerek (Lane és mtsai, 1991) felhasználásával. A Denaturáló Gradiens Gélelektro- forézist (DGGE) mindkét évben valamennyi mintára elvégeztük GC 27f és 518r (Muyzer és mtsai, 1996) univerzális bakteriális, illetve GC CYA359f és CYA78H Cyanobacteria specifikus primerekkel. Az elektroforézis a bakteriális és a cianobaktérium közösség esetében 40-60 % denaturáló gradienst tartalmazó 7, illetve 8 %-os poliakrilamid gélben történt. A kapott elektroforetogramokat TotalLab szoftver segítségével értékeltük ki. A domináns DGGE csíkokat kivágtuk és a reprezentáns kiónokhoz és törzsekhez hasonlóan bázissorrend elemzésnek vetettük alá (Felföldi és mtsai, 2009). Eredmények és értékelésük A Hévízi-tó planktonikus baktériumközösségeire jellemző évszakos és/vagy térbeli eltérések nyomon követésére egy molekuláris ujjlenyomat módszert a DGGE-t használtuk. Az egyes mintavételi időpontokból származó vízminták (01-13) teljes bakteriális (BW), illetve cianobaktérium (CW) közösségszerkezeteinek összehasonlítását a közösségeknek megfeleltethető gélsávok mintázatai alapján készült dendogramok, az 1-4. ábrák szemléltetik. A 2010. évi minták teljes bakteriális közössége (1. ábra) tekintetében 63%-os hasonlóságnál két mintacsoport - nevezetesen az őszi illetve a tavaszi-nyári minták - elkülönülése figyelhető meg. A tavaszi és a nyári vízminták baktériumközösségei kb. 72 %-os hasonlóságnál szétváltak egymástól. A 2010. évi minták cianobaktérium közösségszerkezeti dendrogramja alapján (2. ábra) 63 %-os hasonlóság mellett szintén megfigyelhető a teljes bakteriális közösségre is jellemző tavaszi-nyári, illetve őszi mintacsoportosulás, amely azonban magasabb hasonlósági szinteken nem mutatott további elválást. A 2011-ből származó vízminták teljes bakteriális közösségeinek DGGE mintázata a 2010-es mintákhoz hasonlóan évszakos elkülönüléssel volt jellemezhető (3. ábra). Az előző évitől eltérően azonban 50%-os hasonlóság mellett a tavaszi és a nyári-őszi mintacsoport különült el egymástól. A nyári és az őszi minták kb. 55%-os hasonlósági értéknél szintén szétváltak egymástól. A 2011-es minták cianobaktérium közösségszerkezetei a teljes bakteriális közösségéhez hasonlóan tavaszi és nyári-őszi csoportosulást mutattak 63%-os hasonlóság mellett, további szezonális elkülönülés azonban nem volt megfigyelhető (4. ábra). A 2011. évi tavaszi minták baktériumközösségeinek a nyári-őszi mintáktól való elkülönülésében jelentős szerepet játszhatott a tavon ekkor zajlott felújítási munkálatok keretében elvégzett partfal rekonstrukció üledék felkeverő hatása.
