Hidrológiai Közlöny 2012 (92. évfolyam)

5-6. szám - LIII. Hidrobiológus Napok: „A hidrobiológia szerepe a víz-stratégiákban” Tihany, 2011. október 5–7.

89 Anyag és Módszer Algakivonat előállítása 100 mg liofilizált algatömeg feltárását ismételt fagyasztás-felolvasztás ciklusok során végeztük Helix illetve Lymnaea fiziológiás oldatban (10 ml), a szilád szuszpenziót alkotó sejttörmeléket centrifugálással különítettük el. A felülúszóból vett törzsoldat további hígításait fiziológiás oldattal végeztük, az így előállított mintákat (alga extraktumot) közvetlenül a neuronok felszínére ill. az izolált szív lumenébe juttatuk. Elektro fiziológiai kísérletek Helix pomatia illetve Lymnaea stagnalis izolált központi idegrendszerében a neuronok azonosítása pozíció, méret, aktivitásmintázat alapján történt, az aktivitásuk regisztrálása során standard mikroelektróda-technikát (current clamp módot) alkalmaztunk. A neuronokat két független, K-acetáttal töltött elektróddal szúrtuk, így a farmakológiai tesztek során fellépő membránpotenciál-változásokat polarizáló áram injektálásával kompenzálhattuk, a másik elektródán át történő szimultán potenciál-elvezetés mellett. Az acetilkolint (0,1 M) iontoforetikus injektálással, az al-gakivonatokat fecskendőhöz csatlakozó plasztikcsőből jutattuk a vizsgált sejtek felszínére. Standard fiziológiás oldattal perfundáltuk (1 ml/perc) a kísérleti kamrát, esetenként ebben oldottunk a kísérleti oldatokat (anatoxin-a, d-tubokurarin, ill. algakivonatok). Cianobakteriális kivonatok bioaktiv hatásainak összehasonlító vizsgálatához izommodellként izolált Helix szív preparátumot alkalmaztunk (Walker, 1968). Az izolált szívbe pitvar-kamra irányban perfúzió jutatta a kísérleti oldatokat a szív lumenébe ill. biztosította a gyors kimosást. A szívkontrakciók frekvenciáját optikai detektorral ill. az intracelluláris elvezetéshez is alkalmazott berendezésekkel (erősítő, PC -hez illesztett AD kártya ill. Dasylab program) regisztráltuk. Eredmények és értékelésük Elektrofiziológiai válaszok központi idegrendszeri sejteken Kísérleteinket elektrofíziológiai-farmakológiai tulajdonságaik alapján már azonosított központi idegrendszeri sejteken végeztük. Helix RPas and Lymnaea B1 neuronokon lokálisan applikált 0,1 M acetilkolin serkentést (depolarizációt, majd ezt követő fokozott akciós potenciált) váltott ki (/. ábra Ai.), míg Helix D és Lymnaea B4 neuronjai aktivitásgátlást okozó hiperpolarizációval válaszoltak (/. ábra Aii.). A C. raciborskii ACT 9502 és ACT 9505 törzsek vizes kivonatai (5-10 mg alga szárazsúly/ml koncentrációban) lokális applikálást követően gyakran komplex intracelluláris válaszokat váltottak ki. Az acetilkolinra serkentéssel válaszoló RPas és B1 sejteken ACT algakivonat jelenlétében is erőteljes aktivitásfokozódást tapasztaltunk (/. ábra Bi) míg más neuronokon (D, B4), az algakivonatok által kiváltott serkentő komponens esetenként csökkentette vagy el is fedte (/. ábra Ci) az algakivonat acetilkolinhoz hasonló aktivitást gátló (hiperpolarizáló) membránhatását (/. ábra Bii, Cii). A központi idegrendszeren kiváltott közvetlen membránhatások mellett a C. raciborskii ACT 9502 és ACT 9505 vizes kivonatai a perfúziós oldatban alkalmazva (1-5 mg szárazanyag/ml) a sejten kiváltott acetilkolin válaszokat időszakosan gátolták, vagyis az acetilkolin hatására kiváltható depolarizáció (2. ábra Ai, Aii, Aiii) és a hiperpolarizáció amplitúdója is nagymértékben, de reverzibilisen csökkent. Az algaextraktum applikálását nem minden esetben követte hasonlóan erős depolarizáció ill. aktivitásfokozódás, az acetilkolin válasz amplitúdójának hosszan tartó csökkenése azonban ezekben az esetekben is megfigyelhető volt. Az acetilkolin válasz csökkenése volt megfigyelhető az ismert kolinerg blokkoló 1 |iM tubokurarin (2. ábra B.), illetve az ugyancsak acetilkolin receptorgátló cianotoxin, 10 |iM anatoxin-a jelenlétében is (2. ábra C.). Ai Aii |ACh ACh Bi Bii ACT 9502 ACT 9502 1. ábra. Azonosított sejtek membránjára lokálisan juttatott acetilkolin (ACh), serkentő (Ai) illetve gátló hatásához (Aii) hasonló intracelluláris válaszok regisztrálhatóak algatoxinok (Bi, Bii: ACT 9505, ill. Cii: ACT 9502) jelenlétében, bár a kezdeti serkentő hatás elfedheti a hiperpolarizáló komponenst (Ci). Ai RPas Aii Aiii 30 mV ACh 1 110 mV B 10 pM anatoxin-a j 10 mV 2. ábra. ACT 9505 extraktum (5 mg/ml) közvetlen sejtfelszínre jutatva Helix RPas neuronon erőteljes serkentő hatást (Ai) követően reverzibilisen csökkenti az iontoforetikusan applikált acetilkolin (A Ch) depolarizáló hatását (Aii). Hasonlóan az 5 mg/ml ACT 9502 kivonat (Aiii), a nikotinerg receptorokat antagonizáló tubokurarin (B) illetve kolinerg angatonista cianotoxin, anatoxin-a (C) is reverzibilisen csökkenti az ACh hatását. Anyaghatások izolált Helix szív preparátumon A folyamatosan perfundált izolált Helix szívbe 0,005 |iM küszön-koncentrációtól a fiziológiás oldatba (100-500 nl térfogatú, 5-20 másodperc alatt) juttatott acetilkolin a szívműködést dózisfüggő módon gátolta, a spontán kontrakciók amplitúdójának illetve frekvenciájának csökkenése végül a szívizomzat teljes relaxációját, vagyis az aktivitás gátlását eredményezte (5. ábra Ai, Bi).