Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)
6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.
117 Modern tömegspektrometriai módszerek (MALDI TOF és LC-ESI MS) alkalmazása a vizek hormontartalmának kimutatására Pirger Zsolt'\ Kiss Tibor 1 3, László Zita' 3, G. Tóth László l b, Váczy Alexandra 2, Márk László 2 'MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, "Összehasonlító Állattani és bHidrozoológiai Osztály, Tihany; 2PTE ÁOK, Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet, Pécs Kivonat: Az Európai Szabványoknak megfelelő szennyvíztisztítási technológiák az eltérő eredetű hormonszennyezések eltávolítására jelenleg kevéssé alkalmasak. Ennek következtében a természetes szteroidok mellett a külső szteroidhormon terhelés is szennyezi természetes vizeinket. A vizekben akkumulálódó szteránvázas hormonok, jelentős változásokat okozhatnak az arra érzékeny vízi élőlények endokrin szabályozásában főleg reproduktív rendszerében, megzavarva ezáltal az egyes fajok populációdinamikáját is. Ugyanakkor, a Balaton, a Velencei-tó és a Duna hormontartalmáról csak becsült adatok ismertek ez idáig (kg/év). Munkánk célja az volt, hogy modem, nagy érzékenységű tömegspektrometriai mérőműszerek felhasználásával megvizsgáljuk vizeink ösztrogén, progeszteron és tesztoszteron hormonszennyezését. MALDI TOF tömegspektrométerrel már fmol (! 0 1 5 M) nagyságrendben kimutathatók a szteroid szennyezések a különböző víztestekben. LC-ESI tömegspektrométerrcl meghatároztuk a vízminták tényleges tesztoszteron és progeszteron tartalmát, ami 19-72 ng/l-es koncentrációban voltjelen. Kulcsszavak: tömegspektrometriai módszerek, természetes vizek, hormonszennyezés. A felszíni vizek megóvása több szempontból is jelentős Bevezetés: Az ivóvízkészlet tisztaságának megóvása kiemelt feladat világszerte. A napjainkban alkalmazott, Európai Szabványok szerint működő több lépcsős szennyvíztisztítási technológiák számos természetes és mesterséges hatóanyagot nem képesek eltávolítani a tisztítási eljárások során. így ezek a hatóanyagok akár a kibocsátott tisztított szennyvízzel a felszíni vizekbejutva, akár a hulladéklerakókból, vagy termőföldekre kihelyezett szennyvíziszapból, állati trágyákból kimosódva, komoly szennyező hatással bírnak. A relatív kis koncentrációjú hatóanyagok hatásuk alapján a toxikus gyógyszer-maradványok (pl. zsíranyagcsere szabályozók, béta-blokkolók, fájdalomcsillapítók), a rezisztenciát kialakító gyógyszer-maradványok (pl. antibiotikumok) és a hormonműködésre hatók csoportjába sorolhatók. A tisztított szennyvízből az élővizeinkbe kerülő gyógyszer-származékok, hormonok hatással lehetnek egyed szinten a vízben élő szervezetekre, rendszer szinten a táplálékláncokra (Colborn és mtsai, 1993; Toppari és mtai, 1996; Mol és mtai, 2000; Aida and Barcelo; 2000; 2001; Brossa és mtai, 2002; Kim és mtai, 2007). Az élő szervezetek hormonháztartását befolyásoló természetbe jutó kémiai hatóanyagok három csoportba sorolhatók: fitoösztrogének, a nem szteránvázas szintetikus vagy xenoösztrogének és az emberi vagy állati eredetű szteroidhormonok. A szteroidhormonok családjába tartoznak a természetes ösztrogének (ösztradiol, ösztron, ösztriol), a progeszteron és az androgének (pl. tesztoszteron). A természetbe kijutó szteroidok egy részét az emberi és állati endokrin folyamatok bomlástermékei (Colborn és mtai, 1993; Toppari és mtai, 1996), míg más részét, az orális fogamzásgátló tabletták hatóanyagának bomlástermékei, az ösztrodiol szintetikus formája az etinilösztradiol adja ( Snyder és mtai, 2004). A hormonok és hormonszármazékok biológiai lebontása általában lassú a stabil, több gyűrűs szteránváz (/. ábra), és az esetleges xenofor csoportok miatt, így azok bioakkumulálódnak. A víztestekben akkumulálódó természetes és szintetikus hormonok már kis koncentrációban (ng/1) változásokat idézhetnek elő az egyébként stabil ökoszisztémákban (Toppari és mtai, 1996). Drasztikus változásokat okoznak az arra érzékeny halak, kétéltűek, puhatestűek, ízeltlábúak, primitív táplálékszervezetek endokrin szabályozásában, reproduktív rendszerében, megzavarva az egyes fajok populációdinamikáját is. Az ökoszisztémába bekerülő szteroidok utánozzák és antagonizálják az endogén hormonok (ösztrogének, progeszteron, androgének) hatását, megváltoztatják a természetes hormonok metabolizmusát és szintézisét, valamint módosítják a hormonreceptorok szintjét (Colborn és mtai, 1993; Soto és mtai, 1995; Toppari és mtai, 1996). feladat, akár annak ivóvíz célú hasznosítására, akár a vízi ökoszisztémák egyensúlyára gondolunk. Ugyanakkor, Magyarország vizeiben ez idáig természetes és szintetikus hormonok megjelenését, mennyiségi analízisét átfogóan nem vizsgálták. Célunk volt tehát, hogy a mai modern tömegspektrometriai mérőműszerek (MALDI TOF és LC-ESI) felhasználásával kimutassuk vizeink lehetséges hormonterheltségét. Továbbá, a vizsgálat aktualitását az adta, hogy 2010 a „Víz Éve". tesztoszteron progeszterone 1. ábra - az öt sex szteroid kémiai struktúrája. Anyag és módszer A vízmintákat 100 ml-es üvegedényekbe a Balatonból (É:46°54'50.87", K:17°53'33.41"; Tihany) a Dunából (É: 47°29'42.86", K: 19°02'52.35"; Budapest, Vigadó-tér) és a Velencei-tóból (É:47°l 1'55.82", K:18°35'54.33", Agárd) gyűjtöttük, 2009 áprilisában. A mintákat a felhasználásig 4 C°-on tároltuk, majd a felhasználás előtt 10 percig 13.000 x g-n 4C°-on centrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk (80 ml), majd azt egy vákuumszivattyú (MAXI Dry Lyo, Heto) segítségével bepároltuk. A liofilizált mintákat 1 ml steril bidesztvízben visszaoldottuk. MALDI TOF tömegspektrometria A vízminták hormontartalmának kimutatására az AutoFlex II, mátrix-segített lézer desorpciós /ionizációs repülésiidő tömegspektrométert (MALDI TOF MS; Bruker Daltonics, Bremen, Germany) pozitív és negatív ionizáció alatt reflektor módban használtuk. 50 ml vízmintát megsavanyítottunk 50 ml 1% trifluorecetsawal (TFA; Sigma-Aldrich). A savanyított vízminták 2 ml-ét a hormonok kimutatására alkalmas C 7 0 fullerén kristály bevonatú hordozó fémlemezre (MTP-384; Bruker Daltonics, Bremen, Germany) vittük fel, majd a minták beszáradása után mértük azokat (Montsko és mtai, 2009). A vizsgálat során az ionok gyorsítására 20.0 kV feszültséget használtunk, míg az ionok gerjesztését egy 337 nm-es hullámhosszúságú pulzáló nitrogén lézerrel végeztük (MNL-205MC, LTB Lasertechnik Berlin, Germany). Kontrollként ismert tömegű szintetikus hormonokat (ösztrogének, progeszteron és tesztoszteron; Sigma-Ald-
