Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)
6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.
84 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2010. 90. ÉVF. 6.. SZ. A Hévízi-forrástó üledékének összehasonlító bakteriális diverzitás vizsgálata Krett Gergely 1, Palatinszky Márton 1, Makk Judit 1, Jáger Katalin 1, Csiszár Viktor 2, Márialigeti Károly 1, Borsodi Andrea 1 'ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C. 2Hévízgyógyfürdő és Szent András Reumakórház Kht., 8380. Hévíz, Dr. Schulhof V. sétány 1. Kivonat: A Hévízi-forrástó Európa legmélyebb tőzegmedrü tava. Sajátos üledék mikrobiótája fontos szerepet játszik a tó természetes állapotának és gyógyhatásának fenntartásában. Kutatásunk célja összehasonlító bakteriális diverzitás elemzés volt, különös tekintettel az Actinobacteria törzs tagjaira. Mintavétel a forrástó két pontján eltérő üledékmélységekben történt 2007 októberében. A kilencféle táptalajról származó 245 tiszta tenyészetből nyert és PCR segítségével felszaporított 16S rDNS-t restrikciós enzimekkel hasítottuk. A kapott 122 ARDRA csoportból meghatározott reprezentáns baktériumtörzsek között az Actinobacteria törzsbe tartozó Arthrobacíer, Brachybacterium, Brevibacterium, Curtobacterium, Friedmanniella, Gordonia, Kocuria, Microbacterium, Micrococcus, Micromonospora, Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces és Williamsia nemzetségek jelenlétét igazoltuk. A Bacillus nemzetséggel a törzsek 42%-a mutatott nagy szekvencia hasonlóságot. Molekuláris vizsgálataink során minden mintából közösségi DNS-t izoláltunk, és PCR alapú hosszheterogenitás vizsgálatot végeztünk. A felszíni mintákban a Cyanobacteria és a Chloroflexi, a mélyebb mintákban a S-Proteobacteria domináns jelenléte volt jellemző. Három mintából készítettünk klónkönyvtárat, melyek mindegyikében jelentős számban fordultak elő a Cyanobacteria, a ß- és a 6-Proteobacteria képviselői. Az identifikált baktérium klónok filogenetikai megoszlásában jelentős különbségek mutatkoztak a minták származási helye és mélysége szerint. Kulcsszavak: Hévízi tó, üledék, Actinobacteria, tenyésztés, klónozás. Bevezetés A Hévízi-tó Európa legmélyebb biológiailag aktív, tőzegmedrü forrástava. Gyógyhatása miatt hazánk egyik közkedvelt turisztikai célpontja. Vize kettős eredetű, egy 26°Cos és egy 41°C-os forrásból származik. Medrét vulkanikus és lápi eredetű iszap borítja, amely sajátos baktériumközösségeknek ad otthont. Mind a különleges iszap, illetve az abból származó ásványi anyagok, mind pedig a baktériumközösségek - melyek összetételét még ma is alig ismerjük fontos szerepet játszhatnak a tó természetes állapotának és gyógyhatásának fenntartásában. A Hévízi forrástó üledéke sajátos bakteriológiai viszonyokat tükröz. Szemben más tavak üledékével, Clemente (1981) az üledék felszíni rétegeiből a folyók iszapjára jellemzően nagyszámú streptomicetát mutatott ki, de más tavak üledékében előforduló mikromonospórákat is izolált. Ez a bakteriológiai szempontból átmeneti karakter feltehetően a forrásból táplálkozó tó vizének átfolyó jellegéből következhet. Jelen kutatásunk célja ennek a még rejtőzködő mikrobiális diverzitásnak a feltérképezése volt, különös tekintettel az Actinobacteria törzs tagjaira, melyek változatos - és ipari célokra is hasznosítható - enzimeik és anyagcsere-termékeik révén meghatározó szerepet játszhatnak a tóban végbemenő folyamatok katalizálásában. A vizsgálatokhoz egymással párhuzamosan alkalmaztunk tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független molekuláris biológiai módszereket. Vizsgálati anyag és módszerek A vizsgálatainkhoz felhasznált üledékmintákat a Hévízi forrástó (É: 46,7; K: 17,2) két pontjáról (H3 és H4) vettük 2007. október l-jén Hargrave-féle mintavevővel 2-3 méteres vízoszlop alól. Mindkét mintavételi helyen két üledékmélységből származó mintát gyűjtöttünk, az egyiket tóvízüledék határrétegéből (F), a másikat 20 cm-es üledékmélységből (M). Az egyenként mintegy 200 g-nyi mintát külön steril üvegedényekbe helyeztük, és az egy napon belül történő laboratóriumi feldolgozásig 6-8°C-on tároltuk. Feldolgozás során az üledékmintákból steril víz felhasználásával tízes alapú hígítási sort készítettünk, majd ennek minden tagjából összesen kilencféle tápagar lemez felszínére szélesztettünk, melyek a következők voltak: 1. Keményítő-kazein agar ( Küster és Williams, 1964), 2. Maláta-élesztőkivonat agar (Pridham és mtsai, 1956), 3. Difco Actinomycete izoláló agar (Difco Laboratories, 1962), 4. Keményítő-kazein agar (Waksman, 1961), 5. Micromonospora megalomicea agar (DSMZ-127; www.dsmz.de), 6. Kolloidális kitin agar (Wohl és McArthur, 1998), 7. Czapek agar (DSMZ-83; www.dsmz.de), 8. KingB medium (Cowan, 1974), 9. Zab agar (DSMZ-189; www.dsmz.de). A két hetes, 28°C-os inkubációt követően csíraszám becslést végeztünk, majd a kifejlődött különálló telepeket véletlenszerűen a tápagar lemezekkel azonos összetételű ferde agarra izoláltuk. A molekuláris biológiai vizsgálatok során az 500500 mg-nyi tömör üledékből DNS izoláló kit segítségével (Ultra Clean Soil DNA Isolation Kit, Mo-Bio), kémiai és mechanikus sejtfeltárást alkalmazva, a protokollnak megfelelően kivontuk a közösségi DNS-t. Az izolált DNS-sel két irányban dolgoztunk tovább. Egyrészt polimeráz láncreakció (PCR) alapú hossz-heterogenitás vizsgálatot (LH PCR) végeztünk, ami a 16S rRNS génjének taxononkénti természetes hossz-variabilitásán alapul. Ennek során a 16S rDNS első harmadát - mintegy 500 bázispárnyi szakaszt - felsokszoroztuk PCR segítségével, ehhez TET 63f és 519r primreket használtunk. A forward primer fluoreszcens jelölése tette lehetővé az ABI PRISM 310 Genetic Analyser kapilláris elektroforézis készülékkel történő detektálást. Az izolált DNS másik részét klónkönyvtár létrehozásához használtuk. Ennek során a 16S rDNS egy szakaszát felsokszoroztuk a H3M és H3F minták esetén 27f és 1492r primerek, illetve a H4M minta esetén 63f és 519r primerek segítségével. A PCR termékeket tisztítás után (PCR-M kit, Viogene) kiónozó vektorba ligáltuk (pGEM-T Vector System, Promega) és E. coli JM109 kompetens sejtekbe transzformáltuk. Az inzert szekvencia kinyeréséhez a DNS izolátumokból két PCR-t végeztünk. Az első esetében vektor specifikus Ml3 primereket használtunk. Ezután egy nested PCR-t végeztünk 27f és 1492r primerekkel a H3M valamint H3F mintavételi pontról származó és 63f 519r primerekkel a H4M mintavételi pontról származó minták esetében. Az így kapott PCR termékeket Msp\ és ő.swRI restrikciós enzimekkel (Fermentas) hasítottuk, a különféle hasítási mintázatok alapján az egyes szekvenciákat csoportosítottuk, a mindkét enzimre hasonló mintázatot adókat azonos csoportba helyezve. A baktériumtörzsek genotípusos vizsgálata során a tiszta tenyészetekből elsőként DNS-t izoláltunk G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology) segítségével a gyártó utasításai szerint. Az izolált DNS-ből a 16S régiót polimeráz láncreakció segítségével szaporítottuk fel 27f és 1492r primereket használva. A megsokszorozott 16S rDNS szakaszokat Alu\ és Hin6\ restrikciós endonukleázzal (Fermentas) hasítottuk, majd agaróz gélelektroforézissel 2 %-os agaróz gélben megfuttattuk. Ezáltal láthatóvá váltak az egyes hasítási mintázatok, amely alapján a baktériumtörzsek csoportosítását elvégeztük. A reprezentatív törzsek, és a közösségi vizsgálat során nyert klónok faji szintű azonosítását a 16S rDNS bázissorrend elemzésére alapozva 519r primer felhasználásával a jelölt terminátorú ciklikus szekvenálás módszerével végeztük.
