Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)

6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.

78 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2010. 90. ÉVF. 6.. SZ. Mikrocisztin cianotoxin termelésre képes genotípusok kimutatása molekuláris módszerekkel felszíni vizek eianobaktérium populációiban 'Kovács W. Attila, 2Felföldi Tamás 3Kós Péter, 'Farkas Anna, 4Ács András, 'Győri János, 'Vehovszky Ágnes, 5Szalontai Krisztina 1 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, H-8237. Tihany, Klebelsberg Kuno u. 3. (kovacsa@tres.blki.hu) 2 Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tanszék, H-1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. 3Szegedi Biológiai Központ, 6701. Szeged, Temesvári krt. 41 4Pannon Egyetem, Mérnöki Kar, 8200. Veszprém, Egyetem u. 10. - 5Tihanyi Belső-tó Kht. 8237. Tihany Kossuth L. u. 12. Kivonat: Közismert tény, hogy a cianobaktériumok képesek toxint termelni. A toxint termelő genotípusok detektálása igen fontos gyakorlati jelentőséggel bír, hiszen tömeges elszaporodásuk nemcsak a természetes vizeink esztétikai és turisztikai megítélése szempontjából fontos gazdasági érdek, hanem komoly közegészségügyi probléma is, ahol az ivóvízellátás a felszíni vízkivétellel működő vízmüvek által biztosított. A klasszikus morfológián alapuló mikroszkópi eljárások nem alkalmasak a cianotoxin termelő és a nem termelő genotípusok elkülönítésére. Célunk a molekuláris módszerek bevezetése és alkalmazása a mikrocisztin termelésére képes változatok jelenlétének kimutatására, illetve megjelenésének, elterjedésének nyomon követésére a hazai felszíni vizek eianobaktérium populációiban. A mikrocisztin termelő genotípusok azonosítása a plankton DNS állományában kódolt mikrocisztin szintézisért felelős gének (mcy) kimutatásán alapul, melyek specifikus primereket alkalmazva a megfelelő pozitív kontrollokkal polimeráz láncreakcióval (PCR) sikeresen kimutathatóak. Kulcsszavak: ianotoxin, mikrocisztin, mikrocisztin-szintetáz, PCR. Bevezetés A technológia fejlődésével egyre újabb és korszerűbb módszerek és eljárások kerülnek bevezetésre a hidrobiológia területén is. A molekuláris biológia forradalma hazánkban erre a tudományterületre is betört, mely a klasszikus módszerekkel karöltve új megközelítési lehetőségeket nyújt a természeti jelenségek megismeréséhez, az ott zajló folyamatok mélyebb szintű megértéséhez - kovaalga taxonómia, bakteriális és pikoplankton közösségek diverzitása, cianotoxinok, nádgenetika vizsgálata — (a teljesség igénye nélkül: Beszteri és mtsai 2001, Rusznyák és mtsai 2003, Beszteri és Ács, 2004, Pollák és mtsai 2006, Kovács és mtsai 2007, Lukács és mtsai 2007, 2009, Felföldi és mtsai 2008, 2009, Kovács és Felföldi 2008, Duleba és mtsai 2008, Miseta és mtsai 2008, Jámbrik és mtsai 2009). Közismert tény, hogy a cianobaktériumok képesek toxint termelni, melyekkel való érintkezés komoly egészségügyi problémát okozhat állatok és emberek körében, s ezért fontos megismerni és feltérképezni a toxintermelő változatok előfordulási helyeit (Carmichael 1997; Sivonen és Jones 1999; Briand és mtsai 2003). Nem mindegyik fajra jellemző a toxintermelés, sőt mi több, egy fajon belül is lehetnek olyan egyedek, amelyek nem képesek toxint termelni és olyanok, amelyek képesek. Az adott faj toxint termelő és nem termelő genotípusai előfordulhatnak ugyanabban a populációban is (Kurmayer és mtsai, 2003). A morfológián alapuló mikroszkópi eljárások nem alkalmasak a toxintermelő és a nem termelő változatok elkülönítésére. Ugyanakkor fontos lenne az előrejelzés, cianotoxinok potenciális megjelenési helyeinek behatárolása, amely csak molekuláris technikákon alapuló megközelítéssel lehetséges. A leggyakrabban előforduló toxinok a hepatotoxinok családjába tartozó mikrocisztinek, melyek jelenlétét legelterjedtebben Microcystis, Anabaena, Oscillatoria és Planktothrix fajokban mutatták ki (Mez és mtsai 1997; Frazier és mtsai 1998, Sivonen és Jones 1999). Ezek a vízvirágzást okozó cianobaktériumok fitoplankton közönséges tagjai hazai vizeinknek is. Célunk a molekuláris módszerek bevezetése és alkalmazása a mikrocisztin termelésére képes változatok jelenlétének kimutatására, illetve megjelenésének, elterjedésének nyomon követésére a hazai felszíni vizek eianobaktérium populációiban. Anyag és módszer Munkánk során az 1. táblázatban feltüntetett mintavételi helyekről és időpontokban Microcystis virágzás alkalmával gyűjtött planktonmintákat vizsgáltunk. A merített vízmintákat a laboratóriumba érkezve szürtük (0,45 pm nitrocellulóz filter, Whatman) és kisebb adagokban gyors lefagyasztás után -74 °C-on tároltunk a további feldolgozásig. A mintákban a Microcystis sejtek, kolóniák jelenlétét mikroszkóppal is ellenőriztük. A keresett génszakaszok kimutathatóságának tesztelése során pozitív kontrollként microcisztint termelő Microcystis aeruginosa BGSD 243 eianobaktérium törzsének (Kós és mtsai 1995) és microcisztint tartalmazó (NIVA, Norvégia, Olav M. Skulberg) norvég Microcystis domináns fitoplankton liofilizátum DNS kivonatát alkalmaztuk. Negatív kontrollként Cylindrospermopsis raciborskii Balatonból izolált eianobaktérium törzseit (ACT 9502, ACT 9503, ACT 9504, ACT 9505) és egy zöldalga törzset (Selenastrum capricornutum ACT 97100) használtunk. A kontrollként használt izolált törzseket teljes, illetve nitrogénkötő fajok esetén NaN0

3-mentes BG11 tápoldaton (Rippka és mtsai 1979) szaporítottuk 22 °C hőmérsékleten 80 pmol m"

2 s"

1 fényintenzitáson (US-SQS/L gömbszférikus mikroszenzor, WALZ). A logaritmikus szaporodási fázisban levő algatenyészeteket centrifugálással (2400 g, 10 perc) és szűréssel (0,45 pm nitrocellulóz filter, Whatman) koncentráltuk. Mind az izolátumok, mind a környezeti minták DNS kivonása és tisztítása a Bacterial Genomic DNA Mini-Prep Kit (V-gene Biotechnology Ltd.) segítségével történt a gyártó leírásának megfelelően. A mikrocisztin bioszintézisében kulcsszerepet játszó gének (mcyA és mcyE) szakaszainak amplifikása az 1. táblázatban megadott primerek segítségével történt. A PCR reakciók 25 pl végtérfogata a következő összetevőket tartalmazta: 10 ng genomi DNS, 1,25 pl 20x EvaGreen festék (BIOTIUM Inc.), 12,5 pl 2x Master mix (ImmoMix™, BIOLINE GmbH) és 0,25-0,5 pM a megfelelő forward és reverse primerekből (7. táblázat). A DNS templátok hozzáadása előtt és a sorozat hozzáadása után is készítettünk genomiális DNS-t nem tartalmazó (NTC, non template control) PCR reakció elegyet. Az amplifikációt Rotor-gene 3000 (Corbett Research) RT-PCR készülékben végeztük a I. táblázatban feltüntetett publikációkban közölt protokollok alapján.