Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)

6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.

23 Molekuláris biológiai módszerek alkalmazásának lehetőségei sekély tavaink mikroszkopikus méretű eukariótáinak azonosításában Felföldi Tamás

1, Somogyi Boglárka

2, Vörös Lajos

2, Vida Márton

1 és Márialigeti Károly

1 1 ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. (tamas.felfoldi@gmail.com) 2 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, 8237. Tihany, Klebeisberg Kuno út 3. Kivonat: A baktériumok biodiverzitás-vizsgálatának 1990-es években történt „robbanását" követően az utóbbi évtizedben az mikroszkopikus eukarióta közösségek molekuláris biológiai módszerekkel végzett elemzése jelentett fordulópontot a környezeti mikrobiológiai vizsgálatok terén. A hagyományos módszerekkel a valódi diverzitásnak csak egy része látható, és alkalmazásuk során a morfológiai alapon megkülönböztethető fajok irányába tolódik el a hangsúly. Az elmúlt néhány év kutatási eredményei bebizonyították, hogy a nagyon hasonló alaktani és fiziológiai jellemzőkkel rendelkező apró eukarióták akár egészen távoli leszármazási vonalakat is képviselhetnek. Hasonlóképpen, szoros filogenetikai rokonságban álló csoportok nagyon változatos morfológiai sajátságokkal bírhatnak. Genetikai alapon számos új, korábban még nem azonosított csoport látott napvilágot. Jelen munkánkban néhány hazai sekély tó (Balaton, Fertő tó, Duna-Tisza közi szikes tavak) vizsgálatának példáján keresztül mutatjuk be a mikroszkopikus méretű planktonikus eukarióták molekuláris biológiai módszerekkel történő azonosításának lehetőségeit. Kitérünk a fent említett általános érvényű megállapítások részletesebb ismertetésén túl az alkalmazott módszerek (denaturáló gradiens gélelektroforézis, klónozás és bázissorrend elemzés) előnyeire és esetleges korlátaira, illetve a velük kapcsolatos hibaforrásokra (specifitás, adatbázis használat stb.). Kulcsszavak: pikoalgák, protisták, PCR-alapú molekuláris biológiai technikák, hazai sekély tavak. tak (Stockner, 1991). Ezen két nemzetség fajai molekuláris biológiai vizsgálatok alapján polifiletikusnak bizonyultak, amit több esetben is taxonómiai revízió követett (Huss és mtsai, 1999; Krienitz és mtsai, 2004). Édesvízben azonban inkább a Choricystis, Mychonastes (néhány korábban Chlorella törzs) és Pseudodictyo-sphaerium nemzetségek képviselői alkotják döntően az eukarióta pikofitoplanktont (Padisák és mtsai, 1997; Bevezetés A mikroszkopikus méretű eukarióták jelentős szerepet töltenek be a vízi közösségek életében, azonosításuk kis méretüknek köszönhetően azonban néhány esetben problémákkal jár. A korábbi feltételezés, mely szerint a protisták és algák diverzitásának vizsgálata klasszikus izolálási technikákkal, morfológiai és ultrastruktúrális alapokon megfelelően megoldható, az utóbbi évtizedben megkérdőjeleződött. Továbbá, a molekuláris biológiai módszerek alkalmazása felhívta a figyelmet, hogy számos, eddig nem azonosított csoport létezik közöttük (Moreira és López-García 2002; Bass és Cavalier-Smith, 2004; Not és mtsai, 2007) és több korábbi taxonómiai kategória sem állja meg a helyét (hasonló morfotípusok távoli rokonok lehetnek, illetve filogenetikailag szoros kapcsolatban álló szervezetek változatos alaktani bélyegekkel rendelkezhetnek; Huss és mtsai, 1999; Bass és Cavalier-Smith, 2004; Krienitz és mtsai, 2004). Mintegy tíz évvel ezelőtt pedig leírták az első nagy, nem morfológiai bélyegek, hanem molekuláris filogenetikai elemzések alapján felismert eukarióta csoportot, a Cercozoák törzsét (Cavalier-Smith, 1998). A morfológiai jegyek problémája A mikroszkopikus méretű eukarióták esetében két alapvető probléma van az alaktani bélyegekkel, egyrészt (részben a kis méret következtében) a változatosság meglehetősen szerény egyes csoportoknál, másrészt alacsonyrendű taxonokon belül is eltérő morfotípusok fordulhatnak elő. Másként megfogalmazva, a molekuláris biológiai (főként a 18S rRNS génjén alapuló) filogenetika több esetben nem egyezik a morfológiai alapú klasszikus rendszertannal. A mikroszkopikus eukarióták esetében az utóbbi évekig a taxonómia kizárólag morfológiai alapon megkülönböztethető fajokon alapult. Régóta megfigyelt jelenség, hogy számos alaktani bélyeg nem követ filogenetikai leszármazást, előfordulásukat, megjelenésüket a környezeti-ökológiai-élettani tényezők határozzák meg (a hidrogenoszómák megjelenése anaerob környezetben; egyes flagelláták állábakat, amőbák ostort növeszthetnek a fizikokémiai paraméterek változásának hatására stb.; Bereczky, 1998). Továbbá, mára az is igazolást nyert, hogy a korábban megalkotott (a Fungi, Animalia és Plantae mellett a negyedik) Protista regnum (Whittaker, 1969) inkább szerveződési szintet, semmint származástanilag egységes csoportot jelöl (Bereczky, 1998). A kevés morfológiai bélyeggel rendelkező csoportokra remek példaként említhetjük a kontinentális vizekben előforduló eukarióta pikoalgák (< 2 |im) esetét (1. ábra). Ezek nagyon egyszerű felépítésű (többnyire gömb alakú, általában egy kloroplasztisszal rendelkező) sejtek, amelyeket korábban morfológiai alapon a Chlorella és Nannochloris nemzetségekbe sorolFawley és mtsai, 2005), és a valódi Chlorella fajok csak a tágabban értelmezett pikó méretkategória (< 3 |im) felső határán találhatók. Bebizonyosodott továbbá, hogy sok morfológiai tulajdonság a pikoalgák körében is környezeti hatásokra indukálható (kocsonyaburok megléte vagy hiánya, sejtek alakjának megváltozása; Henley és mtsai, 2004; Krienitz és mtsai, 2004). A hazai molekuláris biológiai eredmények is igazolták a fent említett megállapításokat (Somogyi és mtsai, 2009), sőt szikeseinkben legalább kettő, korábban nem leírt zöldalga csoport jelenlétére derült fény (ACT 0608 és rokonai, valamint a Bu21 klón; 1. ábra). 7?rl— Oloeotila contorts SAG 41.84 — 1 pl Koliella spiculiformis _ 0.02 S3| I Nannochloris bacillaris ® |j Bu21 klón I

6' j Marvania geminala SAG 12.88 Marvania coccoides CCAP 251/1 b® I— Picochlorum atomus CCAP 251/7 _ 9tl_| Picochlorum oklahomensis UTEX 2795 (P) 5

5 Picochlorum oculatum UTEX 1998 t

lSSl Nannochloris eukaryotum UTEX 2502 Chlorella minutissima C-1.1.9 Íj I ACT 0602 : tJLT- ACT 0608 »«'ACT 0622 a • J Meyerella planklonica Itas 2/24 S-1w ® Parachlorella kessleri SAG 211 -11 g — Closteriopsis acicularis SAG 11.86 - Dicloster acualus SAG 41.98 - Muriella terrestris ASIB V38 " Didymogenes palatina SAG 30.92 " Micractinium pusillum SAG 48.93 - Chlorella vulgaris SAG 211-11b f Dictyosphaerium pulchellum SAG 222-2a - Actinastrum hantzschii SAG 2015 " Chlorella lobophora Andreyevs 750-1 • Chlorella sorokiniana SAG 211-40a " Auxenochlorella protothecoides 211-7a Prololheca wickerhamii Pore 1283 _ Mychonastes homosphaera CCAP 211/8e (P) ACT 0617 — Pseudodictyosphaerium jurisii SAG 37.98 ® ACT 0619 »JT MTL »[L 1 An - Chlorella luteoviridis MES A5^> " Chlorella saccharophila SAG 211-9a -I C Sl_i ACT 771 Watanabea reniformis SAG 211-9b Choricystis minor SAG 251-1 (p) T 0605 ACT 0610 - Stichococcus bacillaris K4-4 * Chlorella ellipsoidea CCAP 211/ta - Koliella sempervirens - Trebouxia magna UTEX902 Picocystis salinarum SFBB ® _ I Nannochloropsis limnelica SAG 18.99® ,c

w Eusligmatos magnus CCMP 387 ® - kontinentális vizekben előforduló eukarióta pikoalgák 1. ábra. A kontinentális vizekben előforduló eukarióta pikoalgák leszármazási viszonyai a 18S rDNS alapján [a kiskunsági szikes tavi izolátumok A CT kódszámukkal jelölve, Somogyi és mtsai (2009) alapján, módosítva; a korábban Chlorella és Nannochloris nemzetségekbe sorolt törzsek vastagon kiemelve; a Bu21 klón egy Büdös-székből származó minta klónozásos vizsgálata során került elő, a módszer leírását lásd Duleba és mtsai (2008)/