Hidrológiai Közlöny 2009 (89. évfolyam)

6. szám - L. Hidrológiai Napok: "A hazai hidrobiológia ötven éve" Tihany, 2008. október 1-3.

123 Enzimaktivitás vizsgálatok: Az enzimaktivitások kimutatásához a növényekből 1:1 arányban kivonatokat készítettünk 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 15 mM NaCl, ljxl ml"

1 mercaptoethanol tartalmú pufferrel (Schlereth et al. 2000). A kivonatokat centrifugáltuk (2x5 perc, 13000 g), majd a felülúszókat felhasználásig kis térfogatokban, -20°C-on tároltuk. A kivonatok fehérjetartalmát Bradford módszerével (1976) határoztuk meg. A vízinövények proteáz enzimeinek kimutatásához szubsztrátként (0,4%) zselatint tartalmazó 10%-os poliakrilamid aktivitás géleket alkalmaztunk (Schlereth et al. 2000). Az egyfonalú DNS-t hasító fehérjék kimutatása (1,5 %) egyfonalú csirke vér DNS-t tartalmazó 7,5-15% gradiens géleken történt (Laemmli 1970, M-Hamvas et al. 2003). A felülrétegző gél mintahelyeire egyenlő fehérjetartalmú mintamennyiségeket vittünk fel, melyekhez 2 % SDS-t tartalmazó mintapuffert adtunk. A mintákkal párhuzamosan a molekulatömeg meghatározásokhoz markert is futtattunk (Low Molecular Weight Calibration Kit, Pharmacia). A géleken az enzimaktivitással rendelkező fehérjék sávjait mind a két esetben ún. negatív festéssel tettük láthatóvá, a proteáz gélek esetében Coomassie Blue R250 oldatot (Schlereth et al. 2000), a DN-áz géleknél ethídium-bromidos festést (Gersten és Gábriel 1992) alkalmazva. Eredmények és megbeszélésük Növekedésgátlás, pigmenttartalom 1. táblázat. A CYN gátlóhatása különböző tesztrendszerekben CYN: tisztított (T) / sejteitraktum (S) Tesztnövények Cianobaktérium tenyészet IC

S

0 érték/nap Referencia Felföldy-féle csírázási teszt S / A ovalisporum 5 Dg ml"'/4 nap saját eredmény BGST (fotoperiódus) S / A. ovalisporum 6-10 Dg ml"

1/4 nap saját eredmény BGST (etiolált) T / A. ovalisporum 18,2 Og ml''/3 nap Vasas el al. (2002) Lemna minor SI A. ovalisporum 20 dg ml '/5 nap saját eredmény Wolffia arrhiza S / A. ovalisporum 10 Dg ml"V5 nap saját eredmény Ceratophyllum demersum S / A. ovalisporum >5 •gml"'/19 nap saját eredmény Nicoliana labacum (pollent)T / C. raciborskii 5-1000 Dg ml"' Metcalf et al. (2004) A tesztnövények érzékenysége a cilindrospermopszint termelő cianobaktérium nyers kivonatával szemben jól összevethető a tisztított toxin (CYN) által kifejtett hatással, illetve más növényi tesztrendszerekkel kapott növekedésgátlási adatokkal. Szignifikáns növekedésgátlás (hajtásszám, nedvestömeg, örvszám és pigmenttartalom változások) 5-20 |ig CYN ml"

1 koncentrációtartományban mérhető (/. táblázat; 1-3. ábrák). E N 30 a 2 20 < 1. ábra A CYN hatása a Lemnaceae fajok hajtásszám- növekedésére a kezelés 5. napján 0,05 0,04 0 0,03 2 in ? ? 0,02 c < 0,01 0,00 2. ábra. A CYN hatása a Lemnaceae fajok növekedésére a kezelés 5. napján toxinkoncentráció (mg CYN ml"

1 tápoldat) 4. ábra. A Ceratophyllum demersum örvszám és pigmenttartalom változása a CYN hatására a kezelés 19. napján A hajtásszám alapján a Wolffia érzékenyebbnek bizonyult CYN kezelésekre, mint a Lemna, mert 5 |ig ml"

1 CYN mar a kezelés 5. napján szignifikáns növekedésgátlást okozott (/. ábra). A Ceratophyllum hajtások lassú növekedést mutattak a 19 napos kezelések során, átlagosan egy levélörvöt produkáltak. Az 5 (tg ml"

1 CYN tartalmú tápoldatokban ez a növekedés elmaradt (4. ábra). A nedves tömeg adatokat elemezve szignifikáns csökkenést a Lemna és a Wolffia esetében is csak 10 ng ml"

1 CYN hatására tapasztaltunk (2. ábra). A gátlóhatás a levélkék összklorofill tartalmában is megmutatkozott, a toxinkoncentráció növekedésével arányos csökkenést mutattak (3., 4. ábrák). 10-20 ng ml"

1 CYN hatására a Wolffia, Lemna és a Ceratophyllum hajtásai már szemmel láthatóan is klorotikusak. Enzimmintázat változások WOLFFIA LEMNA CERATOPHYLLUM K 1 2,5 5 10 20 K 1 2,5 5 10 20 MS K 1 2,5 5 MS 1. kép CYN kezelt vízinövények proteáz enzimei a kezelés 5. és 19. napján (pH 8,0; K: kontroll, 1-20 ng mt' CYN kezelt) A CYN kezelések sejtszintű változásokat indukálnak, amit a poliakrilamid aktivitásgéleken detektálható proteáz és nukleáz enzimmintázat változások bizonyítanak (/., 2. képek). Lemna esetében a kontroll és az 1-10 (ig ml"

1 CYN kezelt növények fehérjekivonatai hasonló proteáz enzimmintázatot és aktivitást mutatnak, de a 20 |ig ml"

1 CYN kezelt növények esetében már enzimaktivitás növekedés és új enzimek (32, 35, 38, 58 kDa) toxinkoncentráció (mg CYN ml 1 tápoldal) 0 1 2.5 5 10 20 toxinkoncentráció (mg CYN ml*

1 tápoldat) CoratophylIum/cXvizám - Ceralophyilum/osszklorafill toxinkoncentráció (mg CYN ml

1 tápoldat) 3. ábra A növények pigmenttartalom változása a CYN koncentráció függvényében