Hidrológiai Közlöny 2009 (89. évfolyam)
6. szám - L. Hidrológiai Napok: "A hazai hidrobiológia ötven éve" Tihany, 2008. október 1-3.
105 A fotoszintetikus gének szerepe a pikoalgák molekuláris azonosításában és diverzitásuk vizsgálatában Felföldi Tamás 1, Somogyi Boglárka 2, Vörös Lajos 2 és Márialigeti Károly 1 'ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. (tamas.felfoldi@gmail.com) 2MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, 8237. Tihany, Klebelsberg Kuno út 3. Kivonat: Az utóbbi évtizedben a molekuláris biológiai módszerek meghatározó szerepre tettek szert a fotoautotróf pikoplankton diverzitásának vizsgálatában. A vizek elsődleges termelésében kiemelkedő szerepet játszó pikoalgák a morfológiai jegyek szűkössége miatt a klasszikus vizsgálati eszköztárral nehezen azonosíthatóak. A kutatásokban alkalmazott génszakaszok közül legáltalánosabban használt a riboszómális RNS kis alegységét kódoló gén (SSU rDNS) vizsgálata. Közeli rokon csoportok esetében azonban ez a gén nem rendelkezik megfelelő variabilitással, ezért egyéb szakaszok (nem kódoló régiók, fehéijekódoló gének) is az érdeklődés homlokterébe kerültek. A pikoalgák esetében kézenfekvőnek tűnt a fotoszintézis folyamatában részt vevő fehérjéket kódoló gének alkalmazása a pikoplankton genetikai diverzitásának és filogenetikai viszonyainak vizsgálatában. Ilyen génszakasz például az rbcL gén, ami a RuBisCO enzim nagy alegységét kódolja, a fikobiliproteinek génjei és a II fotorendszer reakciócentrumának Dl proteinjét kódoló gén, apsbA. Jelen munkánkban összegezzük a fotoszintetikus gének alkalmazásának előnyeit és hátrányait az SSU rDNS-sel összehasonlítva, valamint bemutatjuk a hazai pikoalgák fotoszintetikus génekkel végzett diverzitás-vizsgálatainak eredményeit fitoplankton minták és izolált törzsek jellemzésén keresztül. Kulcsszavak: fotoautotróf pikoplankton, PCR-alapú molekuláris biológiai technikák, SSU rDNS, fotoszintetikus gének Bevezetés A sejtek csekély morfológiai változatossága miatt a pikoalgák (pikocianobaktériumok és pikoeukarióta algák) taxonómiai vizsgálatában és azonosításában meghatározó szerep jut a molekuláris biológiai, különösen a PCR alapú módszereknek. A molekuláris evolúció központi modellje szerint azok a biopolimerek, amelyeknek szekvenciájában a véletlenszerű evolúciós változások állandó gyakorisággal fordulnak elő „molekuláris óra", más néven molekuláris (vagy evolúciós) kronométer szerepet nyerhetnek (Zuckerkandl és Pauling, 1965). Egy ilyen kronométernek azonban meg kell felelni bizonyos kritériumoknak legalább a vizsgált csoporton belül: (i) a változás sebessége összemérhető legyen az evolúciós távolságokkal, (ii) a molekulának megfelelő mérettel kell rendelkezni, hogy elegendő információ legyen belőle nyerhető, (iii) univerzálisan előforduljon, (iv) funkcionális szempontból állandó legyen, és (v) ne legyen kitéve laterális géntranszfernek. A legáltalánosabban használt molekuláris kronométerek a riboszómális RNS-t kódoló gének (azaz rDNS-ek). Az összehasonlító bázissorrend elemzésükre alapozott filogenetikai vizsgálatok a piko-méretü algák molekuláris biológiai a lapú jellemzését és csoportosítását tették lehetővé (ami sokszor a már meglévő taxonok létjogosultságának megkérdőjelezével járt) és alapként szolgáltak a környezeti populációk tagjainak azonosításához. A pikoalgák molekuláris azonosításakor kihívást jelent, hogy axenikus (tiszta) tenyészeteket legtöbbször lehetetlen előállítani, az algasejtek mellett sokszor heterotróf baktériumok vagy protisták is megtalálhatók a tenyészetekben. Ezek megnehezíthetik az azonosítást nem megfelelően specifikus PCR primerek hiányában, ugyanis a „szennyező" mikrobák (pikocianobaktériumok esetében a heterotróf baktériumok, pikoeukarióta algáknál a protisták) SSU rDNS-e ugyanúgy vagy rosszabb esetben az algákéhoz képest nagyobb mértékben amplifikálódhat. A probléma még kifejezettebb lehet környezeti minták tenyésztéstől független diverzitás-vizsgálatakor. Ilyenkor megoldást jelenthet olyan génszakaszok használata a pikoalgák azonosítására, amelyek kizárólag csak az ő génállományukban találhatók meg, mint például a fotoszintetikus folyamatokban részt vevő fehéijéket kódoló génszakaszok (fotoszintetikus gének). Közeli rokon csoportok elválasztására szintén alkalmasak lehetnek, hiszen a genetikai kódszótár degeneráltsága miatt (ugyanazt az aminosavat többféle triplet is kódolhatja) a fehéijekódoló gének a nem kódoló régiókhoz hasonlóan nagyobb variabilitással rendelkeznek, mint a rRNS gének. A következőkben a pikoalgák azonosítása és diverzitásuk vizsgálata során legelterjedtebben használt fotoszintetikus gének jellemzőit és alkalmazhatóságukat vesszük sorra (1. táblázat, /. ábra), végül ismertetjük a hazai víztereken fotoszintetikus génekkel végzett kutatások eddigi eredményeit. cpeB(A) - fikoeritrin gén(ek) A pikocianobaktériumok (így az édes és tengervízben előforduló Synechococcusok) különleges fénygyűjtő komplexszel rendelkeznek, a fikobiliszómával (1. ábra), amely kizárólag cianobaktériumokban és vörösmoszatokban fordul elő. A II fotorendszerhez (PS II) kapcsolódó fotoszintetikus antennát fikobiliproteinek (allofikocianin, fikocianin és fikoeritrin) és a hozzájuk kovalens kötéssel kapcsolódó kromofórok, más néven fikobilinek (fikocianobilin, fikoeritrobilin és fikourobilin) alkotják. A cianobaktériumok egy csoportja, a polifletikus leszármazású proklorofiták (köztük a kizárólag óceánokban és tengerekben előforduló piko-méretű Prochlorococcus) azonban a zöld növényekhez hasonlóan nem rendelkezik fikobiliszómákkal, szerepüket a klorofill a 2/b ( 2) tölti be. Épp ezért a Prochlorococcusok az összes fikobiliszóma fehéijét kódoló gént elvesztették, kivéve a fikoeritrinét (Hess és mtsai, 2001). A Prochlorococcusok evolúciósan ősibbnek tekinthető csoportja aktív fikoeritrin génekkel rendelkezik (Hess és mtsai, 1999), amelyek konkrét funkciója azonban ismeretlen. Az evolúciós szempontból fiatalabb Prochlorococcusokban viszont csak a P-alegységét kódoló cpeB gén jelenlétét mutatták ki (Steglich és mtsai, 2003). Valamennyi Synechococcusban egy kópiában (cpeBA) található a fikoeritrin operon, de a fikourobilint is tartalmazó fikoeritrin-gazdag törzseknél két példányban (cpeBA és mpeBA) fordul elő (Everroad és Wood, 2006; Six és mtsai, 2007). cpcBA-IGS - fikocianin operon A régió a fikocianin két alegységét kódoló géneket (cpcB és cpcA) és a köztük lévő nem kódoló, és emiatt jelentős hosszpolimorfizussal rendelkező szakaszt (IGS-t) tartalmazza. A pikocianobaktériumoknál (jellemzően a Synechococcusok nem-tengeri képviselőinél) összefüggést találtak az IGS hossza és a filogenetikai csoportok között (Robertson és mtsai, 2001; Crosbie és mtsai, 2003). Mint korábban utaltunk rá, sem pikoeukarióta algákban, sem proklorofitákban nem található meg. A 16S rDNS és a cpc gének alapján szerkesztett fák öszszehasonlítását nehezíti, hogy számos törzs esetében csak az egyik gén szekvenciája áll rendelkezésre. Molekuláris bio-
