Hidrológiai Közlöny 2009 (89. évfolyam)

6. szám - L. Hidrológiai Napok: "A hazai hidrobiológia ötven éve" Tihany, 2008. október 1-3.

91 tömegprodukciót előidéző szervezeteket. A szervezetek határozását Anagnostidis és Komárek (1988) alapján végeztük. Az azonosított cianobaktériumok laboratóriumi tenyésztése is elkezdődött. Ehhez a vízminta tetején felgyülemlett algatömegből egyszeres Allén tápoldatot tartalmazó 100 mles Erlenmeyer lombikokba oltottunk. A tenyészetek kevertetését rázatással oldottuk meg (Brunswick, 120 rpm). Néhány nap elteltével a tenyészeteket tisztítás céljából centrifugáltuk (Beckman Avanti J-25, 3000 rpm, 5 perc) majd a kapott felülúszót tovább oltottuk. A folyamatot addig ismételtük, míg tiszta tenyészetet kaptunk. Az izolált törzs fenntartása és tenyésztése fényen (max. 35 (.unol m"

2 s"

1) rázatott, illetve levegővel buborékoltatott Erlenmeyer lombikokban (100 ml illetve 4 1) zajlott. A buborékoltatást sterilre szűrt levegővel végeztük, megoldva ezáltal a tenyészetek keverését is. Csíranövény-tesztek: A cianobaktériumok toxicitásának megállapításához a Kós és munkatársai (1995) által, mikrocisztin kimutatására és toxikológiai tesztelésére kidolgozott csíranövény-teszt (BGST - Blue-Green Sinapis Test) módosított változatát alkalmaztuk (Vasas et al., 2000). A sejtmentes cianobaktérium kivonatokhoz a kerti tóból vett vízmintát centrifugáltuk (Beckman Avanti J-25, 10000 rpm, 10 perc). A sejtüledéket liofílezéssel víztelenítettük, majd további felhasználásig -20 °C-on tároltuk. A liofilizált sejtüledéket szonikálással tártuk fel, centrifugáltuk (Fisher Model 59A, 8000 rpm, 5 perc), majd a felülúszót alkalmaztuk a tesztek során. A kezelésekhez alkalmazott sejtmentes cianobaktérium kivonatok koncentrációi a következők voltak: 0,01; 0,1; 1 és 10 mg liofilizátum/ml. A növényeket 22 °Con, sötétben, 4 napig neveltük. A cianobaktériumok angol peije (Lolium perenne) növekedésére gyakorolt toxikus hatásának vizsgálatához kidolgoztuk az angol peije laboratóriumi körülmények között történő neveléséhez szükséges módszert. A kísérletek során Renovaton-gyeppótló pázsit fümagkeveréket használtunk. A fűmagokat Petri-csészékben neveltük, optimalizáltuk a fűmagkeverék csírázásához szükséges tápoldat minőségét, mennyiségét, a megfelelő nedvesség fenntartásához szükséges szűrőpapír réteg vastagságát. A növényeket az előzőkben leírt liofilizátumból készült extraktummal kezeltük, a kivonatok 1,2,3,4,8 mg liofilizátumot tartalmaztak ml-enként. 1/10 x Allén oldattal átitatott szűrőpapírt tartalmazó Petri-csészében nevelt növényeket használtunk kontrollként. Minden edénybe 30 darab előzetes kezelés nélküli fűmagot helyeztünk, ügyelve arra, hogy valamennyi mag azonos nagyságú legyen. A csírázási arányt minden nap megfigyeltük, a gyökér- és hajtáshosszakat mértük a 4., 5., illetve 6. napon. A toxintartalom meghatározása, a különböző mikrocisztinek azonosítása: A vízvirágzásból származóliofilizált sejttömeg 10 mg-ját steril desztillált vízben reszuszpendáltuk, feltárását többszöri fagyasztással végeztük. A mikrocisztinek kapilláris elektroforetikus meghatározásához a micelláris elektrokinetikus kromatográfiás (MEKC) módszert alkalmaztuk (Készülék: Prince CEC-770; kapilláris: poliimiddel borított szilika kapilláris (Supelco; 50 cm x 50 (im, effektív hossz: 42 cm). Injektálás: hidrodinamikus 100 mbar /s; feszültség: 25 kV; elektrolit: 25 mM nátrium tetraborát 100 mM SDS, pH: 9,3; detektálás: diódasoros detektor 239 nm). Az elektroferogramok rögzítését és kiértékelését Dax 3D 8.1 szoftverrel végeztük. A liofilizált sejtek fő tömegéből metanolos extrakcióval vontuk ki a mikrocisztineket. Az extraktumot bepárlás után 10 %-os acetonitrilben vettük fel. Az így kapott kivonatot szemipreparatív HPLC módszerrel tisztítottuk és izoláltuk a különböző mikrocisztin variánsokat (Készülék: Shimadzu LC-10AD VP HPLC; oszlop: SUPELCO Supelcosil"" LC18 25 cmxlO mm, 5 |j.m; detektor: diódasoros UV-VIS detektor). A különböző mikrocisztinek szerkezetének meghatározásához a MALDI-TOF MS analízis pozitív-ion módban Bruker Biflex MALDI-TOF tömegspektrométerrel, a Berlini Műszaki Egyetem Molekuláris Biológiai Tanszékén történt. Az azonosításhoz nyújtott segítséget ezúton is köszönjük dr. Martin Welkernek. Eredmények A kerti tóból azonosított cianobaktérium fajok: A fénymikroszkóppal történő határozás után megállapítottuk, hogy a kerti tóban történt vízvirágzást Microcystis fajok tömeges elszaporodása okozta. A vízmintában a Microcystis aeruginosa, Microcystis viridis, Microcystis ichthyoblabe, Microcystis wesenbergii fajokat azonosítottuk. A tömegprodukciót olyan szervezetek idézték elő, amelyek potenciális toxicitása indokolta a sejttömeg toxicitásának vizsgálatát, részletes toxinanalízisét. A fajok közül a Microcystis aeruginosa-t tudtuk laboratóriumi nevelésbe vonni, a törzs fenntartását a Debreceni Egyetem Növénytani Tanszék algaszobájában végezzük. A csiranövény-tesztek eredményei: A vízvirágzás minta toxicitását megvizsgáltuk a már ismert és laboratóriumunkban alkalmazott mustár csíranövény-teszttel. Valamennyi alkalmazott koncentráció esetében megfigyelhető volt, hogy a növények gyökér- és/vagy hajtáshosszai rövidebbek voltak a kontroll növények esetében mért gyökér- illetve hajtáshosszaknál. Az 1. ábrán jól látható, hogy a kezelt csíranövények gyökerének illetve hajtásainak növekedése gátlást szenvedett. A gyökerek gátlása erőteljesebb, már 0,01 mg ml"

1 liofilizátumot tartalmazó kivonat több mint 10%-kal csökkentette a gyökerek növekedését (1. ábra). 1 mg ml"

1 koncentrációnál a gyökérhosszak 60%-kal (1. ábra, fekete rombuszok), a hajtáshosszak 30%-kal rövidebbek a kontroliban mérhető értékekhez képest (1. ábra, fekete négyzetek). 120 100 80 ? m •o •g 60 o > « z 40 20 0 1. ábra. A mustár csíranövények gyökér- és hajtáshosszainak növekedése a kezeléshez alkalmazott cianobaktérium kivonat koncentrációjának (mg liofilizátum mi') függvényében. 100% a kontroll rendszerben mérhető gyökér- illetve hajtáshossz. -•-gyökérhossz 0 0.01 0.1 1 10 mg Microcystis NofHizátum/ml