Hidrológiai Közlöny 2008 (88. évfolyam)

6. szám - IL. Hidrobiológus Napok: „A Balaton és vízrendszere – a Balaton-kutatás története” és „A Duna-kutatás története” Tihany, 2007. október 3–5.

108 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2008. 88. ÉVF. 6. SZ. Természetes vizek potenciális cianotoxin-termelő képességének molekuláris vizsgálata 'Kovács W. Attila, 2Felföldi Tamás 'MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, H-8237. Tihany, Klebeisberg Kuno út 3. (kovacsafrf trcs.hlki.hu) 2Eötvös Loránd Tudományegyetem, Mikrobiológiai Tanszék, H-1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. Kivonat: A cianobaktériumok folyamatos térhódítása, teijeszkedése kiemelt helyet foglal el az algológiai kutatások területén világszerte. Ismert tény, hogy a cianobaktériumok, s közöttük különösen a nitrogénkötő fajok számos törzse képes különböző cianotoxinokat termelni. Célunk a felszíni vizek cianobaktérium populációinak „átvilágítása" a toxintermelő (cilindrospermopszin, mikrocisztin, nodularin) változatok jelenlétének kimutatása, a toxinszintézisben részt vevő enzimek specifikus génszakaszaira tervezett primerek alkalmazásával. A morfológián alapuló mikroszkópi eljárások nem alkalmasak a toxintermelő és a nem termelő változatok elkülönítésére vagy a már megtermelt toxin kimutatásán alapulnak. A toxinok potenciális termelődésének vizsgálatában, az élővízben való nagy mennyiségű megjelenésük előtti detektálásában ezért a molekuláris biológiai megközelítés kulcsszerepet kap. Jelen tanulmányban a hazánkban nemrégen bevezetett PCR alapú módszer (Kovács és mtsai, 2007) kiteijesztését ismertetjük a cianotoxinok szélesebb körének vizsgálatára, valamint bemutatjuk a módszer érzékenységének megállapítására irányuló vizsgálataink eredményeit. Kulcsszavak: cianotoxin, cilindrospermopszin, mikrocisztin, nodularin, peptid-szintetáz, poliketid-szintáz, mikrocisztin-szintetáz, PCR. Bevezetés A cianobaktériumok folyamatos térhódítása és teijeszkedése következtében kutatásuk kiemelt helyet foglal el az algológia területén világszerte. Ismert tény, hogy a cianobaktériumok (

Microcystis, Planktothríx), s közöttük különösen a nitrogénkötő fajok (Aphanizomerton, Anabaena, Cylindrospermopsis raciborskii, Nodularia spumigena) számos törzse képes különböző cianotoxinokat termelni (Frazier és mtsai, 1998; Schembri és mtsai, 2001; Mazur és Plinski, 2003; Preußel és mtsai, 2006; Mohamed és mtsai, 2007). Ezen adaptív szervezetek toxikus válfajainak detektálása igen fontos gyakorlati jelentőséggel bír, hiszen tömeges elszaporodásuk nemcsak a természetes vizeink esztétikai és turisztikai megítélése szempontjából fontos gazdasági érdek, hanem komoly közegészségügyi probléma is, ahol az ivóvízellátás a felszíni vízkivétellel működő vízművek által biztosított. A morfológián alapuló mikroszkópi eljárások nem alkalmasak a toxintermelő és a nem termelő változatok elkülönítésére. Az eddig alkalmazott technikák (HPLC, CE, ELISA) pedig a már megtermelt toxin kimutatásán alapulnak. A toxinok potenciális termelődésének vizsgálatában, az élővízben való nagy mennyiségű megjelenésük előtti detektálásában ezért a molekuláris biológiai megközelítés kulcsszerepet kap. Célunk molekuláris módszerek bevezetésével a hazai felszíni vizek cianobaktérium populációinak „átvilágítása" a toxintermelő (cilindrospermopszin, CYN; mikrocisztin, MC; nodularin, NOD) változatok jelenlétének kimutatása, ill. megjelenésének nyomon követése. Anyag és módszer Az alkalmazott módszer érzékenységének vizsgálatára, Balatonból izolált, a CYN termelés markergénjeit (poliketid-szintáz, PKS és peptid-szintetáz, PS) bizonyítottan nem tartalmazó Cylindrospermopsis raciborskii törzset (ACT 9502, Kovács és mtsai, 2007) és pozitív kontrollként az Ausztráliában izolált, bizonyítottan CYN termelő toxikus C. raciborskii törzset (AQS, más jelöléssel CR3) használtuk (Valério és mtsai, 2005). Az törzseket NaN0

3-mentes BG11 tápoldaton (Rippka és mtsai, 1979) szaporítottuk 26°C hőmérsékleten 80 |jmol m'V

1 fényintenzitáson (US-SQS/L gömbszférikus mikroszenzor, WALZ). Kiindulva egy közepes algavirágzás fonal számából (10

7-10

8) az ACT 9502 és AQS törzsek különböző hígításait készítettük el (/. táblázat). Minden egyes keverési változatból 4 párhuzamost készítettünk. A keverési arány beállításához a logaritmikus szaporodási fázisban levő algatenyészetek fonalszámát fordított plankton mikroszkóppal 2 ml-es ülepítő-kamrát használva (±5 %, n > 1600) határoztuk meg (Lund és mtsai, 1958). Az ismert fonalszámú tenyészetekből hígítási sorozatokat készítettünk steril NaN03-mentes BG11 tápoldat felhasználásával. A PKS és PS gének detektálását Kovács és mtsai (2007) alapján végeztük. Eredmények és megbeszélésük A potenciális toxin-termelő képesség kimutatásának molekuláris háttere Közismert tény, hogy a cianobaktériumok képesek toxint termelni, melyekkel való érintkezés komoly egészségügyi problémát okozhat állatok és emberek körében, s ezért fontos megismerni és feltérképezni a toxintermelő változatok előfordulási helyeit (Carmichael, 1997; Sivonen és Jones, 1999; Briand és mtsai, 2003). Nem mindegyik fajra jellemző a toxintermelés, sőt mi több egy fajon belül is lehetnek olyan egyedek, amelyek nem képesek toxint termelni és olyanok, amelyek képesek. Az adott faj toxint termelő és nem termelő genotípusai előfordulhatnak ugyanabban a populációban is (Kur

may er és mtsai, 2003). Eddig a vízvirágzások toxikus jellegének detektálására, a jelenlévő cianotoxinok azonosítására modern elválasztási és immunológiai módszereket alkalmaztak (HPLC, CE, ELISA). Ezen technikák a már megtermelt (esetlegesen már felszabadult) toxinok kimutatásán alapulnak. Ugyanakkor nagyon fontos lenne az előrejelzés, cianotoxinok potenciális megjelenési helyeinek behatárolása, amely csak molekuláris technikákon alapuló megközelítéssel lehetséges. Az ezredforduló elején jelentek meg azok a riportok, amelyek bizonyították, hogy molekuláris módszerekkel a toxintermelés képessége laboratóriumban tenyésztett törzsekben kimutatható (Schembri és mtsai, 2001; Tillett és mtsai, 2001). Az alkalmazott módszer azon alapult, hogy a toxint termelő genotípusok DNS állományában a toxin szintézisért felelős gének megtalálhatók, és szekvenciá-