Hidrológiai Közlöny 2008 (88. évfolyam)
6. szám - IL. Hidrobiológus Napok: „A Balaton és vízrendszere – a Balaton-kutatás története” és „A Duna-kutatás története” Tihany, 2007. október 3–5.
55 Duna-Tisza közi szikes tavak pikoplanktonjának molekuláris biológiai jellemzése Felföldi Tamás 1, Somogyi Boglárka 2, Márialigeti Károly 1 és Vörös Lajos 2 1 ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. (tamas.felfoldifmimail.com) 2 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, 8237 Tihany, Klebeisberg Kuno út 3. Kivonat: A Kárpát-medence különleges, időszakosan sokszor teljesen kiszáradó sekély víztestei meglehetősen nagy mennyiségű fotoautotróf pikoplanktonnal rendelkeznek. Ezek a 2 ^im alatti szervezetek méretük és kis morfológiai változatosságuk miatt taxonómiai szempontból a hagyományos módszerekkel legtöbb esetben nem jellemezhetőek. Az utóbbi években a molekuláris biológiai módszerek központi szerephez jutottak a pikoplankton vizsgálatában (törzsek azonosítása, denaturáló gradiens gélelektroforézis, klónozás és bázissorrend elemzés stb.), és bebizonyosodott, hogy a látszólag csekély alaktani változatosság mögött jelentős genetikai különbségek állhatnak. Az általunk vizsgált Duna-Tisza közi szikes tavak fotoautotróf pikoplanktonja szintén jelentős genetikai változatossággal jellemezhető, és mind a prokarióta (cianobaktériumok), mind az eukarióta képviselők között találhatók különleges, korábban még nem azonosított csoportok. Kulcsszavak: szikes tavak, fotoautotróf pikoplankton, PCR-alapú molekuláris biológiai technikák, Synechococcus, Chlorella Bevezetés A Kárpát-medence különleges, időszakosan sokszor teljesen kiszáradó sekély víztestei szalinitásukat tekintve meglehetősen változatos képet mutatnak az évszak és a vízszint függvényében (vezetőképesség: 3000-16000 p.S/ cm). Habár a magyar algológiai vizsgálatok meglehetősen intenzíven zajlottak az elmúlt évtizedekben, a szikes tavak fotoautotróf pikoplanktonja (2 |tm alatti szervezetek) csak az elmúlt néhány évben került az érdeklődés homlokterébe (Vörös és V.-Balogh, 2003; Vörös és mtsai, 2005). Megállapítást nyert, hogy ezekben a vizekben a fitoplanktont zömében (74-100%-ban) a vörösen fluoreszkáló, kokkoid, 1 |im átlagos méretű egysejtű algák alkotják, melyek mennyisége meghaladhatja a nemzetközi irodalomban leírt legmagasabb értékeket is. A szikesekben élő pikoalgák különleges jelentőségét jelzi az a tény is, hogy ezek a hipertróf vizes élőhelyek nem követik azt a tengerekben és édesvizekben egyaránt általános jelenséget, miszerint az autotróf pikoplankton részesedése a fitoplankton teljes tömegéből és produkciójából a trofitás növekedésével csökken (Stockner, 1991). A fotoautotróf pikoplankton mennyiségi meghatározását az epifluoreszcens mikroszkópia (Johnson és Sieburth, 1979; Waterbury és mtsai, 1979, Vörös, 2004) és az áramlási citometria ( Chrisholm és mtsai, 1988; Li és Wood, 1988; Olson és mtsai, 1990) egyaránt lehetővé teszi, pontos filogenetikai azonosításukhoz azonban a molekuláris biológiai eszköztár elengedhetetlen. Ez részben a kis sejtmérettel és a morfológiai jegyek szűkösségével, részben a nehéz és körülményes tenyészthetőségükkel kapcsolható össze. Az utóbbi két évtizedben rohamos fejlődést mutató molekuláris technikák nemcsak az izolált pikoalga törzsek pontos rendszertani meghatározását tették lehetővé ( Urbach és mtsai, 1998; Honda és mtsai, 1999; Huss és mtsai, 1999; Turner és mtsai, 1999; Robertson és mtsai, 2001; Crosbie és mtsai, 2003), hanem a fitoplankton minták közvetlen DNS-alapú vizsgálatára irányuló kutatások felhívták a figyelmet egy jelentős, eddig tenyésztésbe nem vont pikoplankton frakcióra is (/vanikova és mtsai, 2007). Munkánk során célul tűztük ki a hazai szikes tavak pikoplankton közösségeinek molekuláris biológiai alapú azonosítását. A pontosabb meghatározás reményében ehhez izolált pikoalga törzseket és fitoplankton mintákat egyaránt felhasználtunk. Anyag és módszer A pikocianobaktérium törzsek izolálására a Böddi-székből vett vízmintából (2005. dec. 12.) került sor szélesztéses technikával Brackish Water Medium (E. G. Pringsheim és W. Koch alapján, Sammlung von Algenkulturen, Göttingen) táptalajon. Az izolátumok azonosítását a 16S rDNS és a cpcBA-IGS (fikocianin operon) régiók alapján is elvégeztük. Röviden, a Genomic DNA Mini-Prep Kit (V-gene Biotechnology Ltd.) felhasználásával végzett DNS kivonást 16S rDNS esetén CYA106F és CYA781R (Nübel és mtsai, 1997), a fikocianin operon esetén pedig cpcBF és cpcAR primerekkel ( Robertson és mtsai, 2001) végzett PCR követte a megadott referenciákban közölt paraméterekkel. A kapott termékeket PCR-M™ Clean-Up DNA (Viogene) kit segítségével tisztítottuk, majd a szekvenáló reakciókat Big Dye" Terminator v3.l Cycle Sequencing Kittel (Applied Biosystems) végeztük el. A kromatogramok manuális korrekcióját követően (Chromas vl.45, Technelysium Pty Ltd.) a szekvenciákat GenBank nukleotid adatbázissal hasonlítottuk össze (Altschul & mtsai, 1997). A filogenetikai fákat MEGA3 (Kumar és mtsai, 2004) programcsomaggal szerkesztettük Neighbor-Joining módszerrel Kimura 2-paraméteres nukleotid szubsztitúciós modellt alkalmazva. A fitoplankton minták mintavételi időpontját és helyét az 1. táblázatban tüntettük fel (mintavételi helyek koordinátáit ld. Boros, 2007). 50-100 ml mintához a koncentrálást követően (5000 g, 10 min) 0,6 ml CLS-Y-t (Bio 101 Systems, QBiogene), 300 mg üveggyöngyöt és spatulahegynyi PVPP-t (polivinil-polipirrolidon) adtunk. A sejtek feltárása Retsch MM301 típusú sejtmalommal történt (1 min, 30/s). A genomi DNS tisztításának menete teljes mértékben megegyezett a törzsek esetében leírtakkal. A 16S rDNS PCR-t két lépcsőben végeztük: a 27F és 1492R primerekkel (Lane, 1991) kapott termékre újabb reakciót mértünk a GC-CYA359F és CYA781R primerek (Nübel és mtsai, 1997) felhasználásával. A denaturáló gradiens gélelektroforézist (DGGE-t) 1 mm vastag 8 v % poliakilamid gélben végeztük 40-60 % denaturáló koncentráció mellett (a 100 %-os denaturálószer 40 % formamidot és 7 M ureát tartalmazott). Az elektroforézis lx TAE pufferben 100 V-on és 60°C-on 15 órán keresztül zajlott INGENYphorU-2 rendszerben (Ingeny International BV). Az etídium-bromidos festést és az UV fényben történő képrögzítést követően az egyes sávokat kivágtuk és a DNS-t kivontuk 20 jtl DECP-kezelt vízben (Roth) történő 12 órás inkubációval. Ezt követően megismételtük a Nübel és mtsai (1997) által leírt primerekkel végzett PCR-t, majd a termékek tisztítását és a bázissorrend elemzést a törzsek esetében leírtakkal megegyezően végeztük el.
