Hidrológiai Közlöny 2007 (87. évfolyam)
6. szám - XLVIII. Hidrobiológus Napok: Európai elvárások és a hazai hidrobiológia Tihany, 2006. október 4–6.
41 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2007. 87. ÉVF. 6. SZ. A savas foszfatáz aktivitás jelentősége egy tőzegmohalápban Grigorszky István 1, Borics Gábor 2, Béres Viktória 3, Farkas Tünde 4 'Debreceni Egyetem, Hidrobiológia Tanszék, 4032. Egyetem tér 1. 2 Tiszántúli Környezetvédelmi-, Természetvédelmi-, és Vízügyi Felügyelőség, 4032. Debrecen Piacz 9/b. 'Debreceni Egyetem, Növénytani Tanszék, 4032. Egyetem tér 1. 4Aggteleki Nemzeti Park Igazgatóság, H-3758. Jósvafő Tengerszem oldal 1. Kivonat: A felszíni vizekben levő biológiai rendszerek funkcionális viszonyainak mind jobb értelmezésében a különböző enzimek mérése és azok működése jelentős kihívás. A foszfatázok jelentősége abban áll, hogy hozzáférhetővé teszik az élőlények számára az egyik legfontosabb tápanyagot, a foszfort, melynek fokozott mértékben való dúsulása a trofitás szempontjából nem kívánatos jelenség. Igyekeztünk egy olyan vizsgálati objektumot választani, ahol vélhetőleg kevés enzim egyidejű működése áll fenn. Emiatt eset a választásunk egy „savanyú lápra", ahol a pH állandóan 3 alatt van és a savas foszfatázok mérésére nyílik lehetőség. A vízminta különböző pórusátmérőjű szűrőkkel végzett frakcionálásának foszfatázaktivitás mérését végeztük el, amely a legnagyobb aktivitást (>60%) a 0,45 (im-nél kisebb frakcióknál mutatta. A kibocsátás mértéke a legnagyobb májusban (15 nmol l-l min -1) és júniusban (25 nmol l-l min -1) volt, a Gonyostomum semen (Raphidophyta) tömeges előfordulása idején, de két héten belül kevesebb, mint 2 nmol l-l min-1 értékre esett vissza, majd a nyár és az ősz folyamán ez az érték állandósult, ill. csökkent is. A [ 3 2P]H3P0 4-tal jelölt oldott szerves foszfor azt mutatta, hogy ez a frakció az év során jelentős változékonyságot mutatott és ez jól mérhető. Munkánk során kidolgoztunk egy olyan eljárást, amellyel a kutatók gyorsan és hatékonyan kimutathatják a tőzegmoha lápokban egyik legfontosabb enzimet, a savas foszfatázt. Kulcsszavak: Savas foszfatáz, kelemén Kis-Mohos, Gonyostomum semen, Raphidophyta,. Bevezetés Napjainkban egyre nagyobb az igény arra, hogy a terepi vizsgálatok során olyan, eddig csak laborkörülmények között végzett vizsgálatok is alkalmazhatóak legyenek, mint például az enzimmérés. Köztudott, hogy a kémiai és biológiai folyamatok katalizátorai az enzimek. Bár az enzimek mérése (optimumok beállítása, rövid reakció idő) néha még laboratóriumi körülmények között is összetett feladat, egyértelmű, hogy hosszúvávon elengedhetetlen az egyes enzimek mennyiségének ismerete, hisz csak így kaphatunk teljes képet a természetes vízben lezajló folyamatokról. A tengervizek esetében napjainkban már megoldódni látszik az enzimmérés, azonban a kontinentális vizekben található enzimek gyors mérése még nem megoldott probléma. A foszfatázok jelentősége abban áll, hogy több típusuk hozzáférhetővé teszi az élőlények számára az egyik legfontosabb tápanyagot, a foszfort. Mivel a foszfor az egyik legfontosabb tápanyag, amely a biológiai produktivitást korlátozhatja a tavakban (Wetzel 1983), az oldott szerves foszforvegyületek (DOP) - amennyiben róluk foszfát válik le - befolyásolhatják a fitoplanktont alkotó fajok táplálkozását. Bár az ortofoszfát az összfoszfornak sokszor csak kevesebb mint 5%-át teszi ki (Wetzel 1983), a fitoplankton fajok leginkább ebben a formában asszimilálják közvetlenül a foszfort (Lehman 1980). Némely szerves foszforvegyület képes ortofoszfát-kibocsátásra (Francko és Heath 1979), így bizonyos körülmények között táplálkozási szempontból fontos szerepet játszhat. Francko és Heath (1979) a komplex foszforvegyületek két funkcionális csoportját határozta meg, amelyek eltérő módon bocsátanak ki foszfátot. A vegyületek egyik csoportjáról úgy válhat le foszfát, hogy a foszfatáz enzimek katalizálják a foszfomonoészterek végállású kötéseinek felbomlását (Fitzgerald és Nelson 1966). A foszfatáz összefüggésbe hozható az algák (Kuenzler és Perras 1965; Berman 1970) vagy a baktériumok (Reichardt és mtsai. 1967) sejtfalával. Az enzimek a vízbe a Zooplankton fajok kiválasztása (Boavida és Heath 1984) vagy algák sejtfalának bomlása, algatest szétesése révén kerülnek (Berman 1970). Évszaktól függően a teljes foszfatáz aktivitás legalább 50%-a történhet oldható, nem részecske fázisban (< 0,5|im) (Wetzel 1981). Ezek az enzimek a pH optimumuknak megfelelően savas vagy lúgos foszfatázok. Mindkét foszfatáz típus termelődhet az alacsony foszfát koncentráció következményeképpen (Jansson és mtsai. 1981). A vegyületek második csoportja egy olyan folyamat révén bocsát ki foszfátot, amelyben szerepe van a humuszos anyagok vasionjainak fotoredukciójának (Francko és Heath 1983). Nem ismert, hogy az ezen vegyületek által kibocsátott foszfát elegendő mértékü-e ahhoz, hogy táplálkozási szempontból jelentős szerepet játsszon. A jelen tanulmány a foszfomonoészterek (PME) potenciális jelentőségét elemzi a planktonikus élet szempontjából azáltal, hogy a vegyületek foszfát-kibocsátásának mértékét becsüli meg. A vizsgálatot egy savas tőzegmoha-lápban, a keleméri Kis-Mohosban végeztük, Magyarországon. A lápban az oldott szerves anyagok nagy koncentrációban vannak jelen, ami növeli a szerves foszforvegyületek mint foszfátforrás esetleges jelentőségét. Anyag és módszer A vizsgálati terület. Vizsgálatainkat 2001-ben végeztük. A kcleméri Kis-Mohos egy 8-10 millió éves, 2 ha területű tőzegmohaláp. A lápot körülölelő nyíltvíz pH-ja éves szinten 2,5 és 5,1 között változik. A lápon a Sphagnum fajok dominálnak. A domináns fitoplankton taxon, a Gonyostomum semen (Raphidophyta) volt. Analitikai eljárások. A vízmintákat a nyíltvíz 30 cm mélységéből vettük. A vizet polipropilén palackokba töltöttük, amelyeket előbb kimostunk, savval öblítettünk, autoklávoztuk és a vizsgálat helyén vett vízzel kiöblítettünk. A palackokat alufóliába tekertük, hogy a szerves vegyületek fény hatására történő bomlását megakadályozzuk. A hőmérsékletet és az oxigén koncentrációt a helyszínen megmértük. A mintákat a mintavételtől számított 90 percen belül a laboratóriumba szállítottuk. Az oldható reaktív foszfor mennyiségét spektrofotometriai molibdát-aszkorbinsavas eljárással mértük (Murphy és Riley 1962). A teljes foszfor tartalmat perszulfáttal 60 percig végzett savas hidrolízis után mértük (USEPA 1971). A feofitinnel korrigált klorofill-a-t Strickland és Parsons eljárásával (1968) határoztuk meg. Foszfomonoészterek foszfát-kibocsátása A láp vízének foszfomonoészter koncentrációját úgy határoztuk meg, hogy vizsgáltuk a kimutatható SRP növekedését, foszfatázzal hidrolízist végeztünk 5,0 pH értéken és 37 °C-on. Az analízis előtt a láp vízét 0,45 fim lyukbőségű hálón szűrtük át, amelyet korábban 0,5 mol L-l HCl-dal és desztillált vízzel öblítettünk át. A foszfatáz (Sigma) oldódása során a végső koncentráció 0,5 mg foszfatáz ml1 volt lmol l-l nátriumacetát pufferoldatban, és 0,01 mol L-l MgCb 5,0 pH érték mellett. Ezt a reagenst szűrt lápvízzel kevertük 1: 9 arányban, és 37°C-on inkubáltuk, t„ értéknél egy 2,5ml-es részt eltávolítottunk, 0,5ml molibdát reagenst és 0,2ml aszkorbinsavat adtunk hozzá, és az abszorpcióképességet vizsgáltuk 885nm értéken. A PME teljes hidrolízise után (22-24 óra) újabb egységnyi mennyiséget vettünk, és hasonló eljárásnak vetettük alá. A savas foszfatáz aktivitást Boavida és Heath módszerével (1984) vizsgáltuk. A p-nitrofenil foszfát (pNPP) hidrolízisének sebességét spektrofotometriai eljárással mértük, amelyben a p-nitrofenil termelés mértéke az abszorpcióképesség növekedésének mértékének felelt meg 395 nm értéken. Meghatároztuk a szubsztrát K m és Vmax értékekeit. A mintákat 0,1 mol L-l nátrium-acetátban és 0,01mol L-l MgCU-ban inkubáltuk, 5,0 pH értéken és 37 °C-on. A K m értékét grafikusan határoztuk meg (mint az s/v és az s görbék metszését), ahol s a szubsztrát koncentráció, és v a szubsztrát hidrolízisének mért sebessége (Hanes 1932). Oszlop kromatográfia A tó vizét 3 2P H3PO4 -tal jelöltük az utolsó 400 Bq ml-1 méréshez, és 30 óra inokuláció után 0,45 pm lyukbőségű hálón szűrtük át. A 3 2P H3PO4 30 óra elteltével egyensúlyba került minden foszfor komponensben. Minden 10 ml-es mintát eluáltunk 0,01 mol L1 kálium acetáttal Sephadex G-25 finomszemcsés gél-oszlopon keresztül, és 4°C-on, 1,0ml min -1 áramlási sebesség mellett. Az oszlopot Blue Dextran és 1 x 10-6 mol L-l foszfát oldatával kalibráltuk, 1500 dpm ml-1 3 2P H,P0 4 -tal „tüskézve". A jelölt víz eluálása
