Hidrológiai Közlöny 2007 (87. évfolyam)
4. szám - Kovács Tünde–Ács András–Kováts Nóra–Paulovits Gábor: Daphnia pulex táplálkozási aktivitásának gátlása cianobakteriális toxiditás hatására
26 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2007. 87. ÉVF. 4. SZ. jából legfontosabbnak a Zooplankton tesztszervezeteken végzett vizsgálatok tűnnek. Szabványos Zooplankton tesztek (pl. az MSZ EN ISO 6341:1998: Vízminőség. A mobilitás gátlás meghatározása Daphnia magna Strauson (Cladocera, Crustacea). Akut toxicitási teszt c. szabvány) végpontja (a teszt során mért paraméter) mobilitásgátlás, azaz gyakorlatilag mortalitás. Az ökotoxikológiai kutatások ugyanakkor nemcsak arra irányulnak, hogy olyan új tesztszervezeteket vonjanak be, amelyek segítségével a valós befogadók/terhelést viselő ökoszisztémák újabb elemeit reprezentálják, hanem lehetőség szerint a mortalitás-vizsgálatokat kiváltó, szubletális végpontokat találjanak. A MicroBioTests Inc. által forgalmazott Rapidtoxkit 1 tesztszervezete a Thamnocephalus platyurus (szintén Zooplankton szervezet, héjnélküli kisrák), maga a teszt pedig táplálkozási aktivitást, pontosabban ennek valamilyen mérgező anyag által okozott gátlását vizsgálja. Maga a teszt rendkívül egyszerű: a Thamnocephalus lárvákat először 15-60 perces expozíciónak tesszük ki, majd piros színű mikroszemcséket tartalmazó, már nem toxikus közegbe helyezzük át őket. Mivel a piros mikroszemcsék elfogyasztása szabad szemmel is értékelhető (a lárvák bélcsatornája piros), számszerűsíthetjük, a tesztszervezetek hány százalékában váltott ki hatást a vizsgált toxikus anyag. A Thamnocephalus platyurus érzékenysége számos szennyező komponensre kiválónak bizonyult, cianobakteriális toxicitás kimutatására is több szerző ajánlja (pl. Törökné, 1999; Reskóné és Törökné, 2000; Tarczynska et al„ 2000; Marsalek és Blaha, 2004; Bartoszewicz et al„ 2006). Mivel ez a tesztszervezet hazánkban nem őshonos (észak-amerikai fajról van szó), kísérleteink alanyául a Daphnia pulex-et választottuk, hazai vizeink ökoszisztémáját reprezentálandó. A Daphnia fajok az édesvízi tápláléklánc meghatározó elemei, ráadásul táplálékuk között Microcystis kolóniák is megtalálhatók (Schoenberg és Carlson, 1984). A szabvány mobilitásgátláson alapuló Daphnia teszt ugyanakkor több szempontból sem tűnik megfelelőnek a cianobaktériumok jelentette környezeti kockázat értékelésére. Marsalek és Blaha (2004) 17 akut ökotoxikológiai teszt érzékenységét vetette össze cianobakteriális toxicitás kimutatására, a tesztszervezeteket a mutatott érzékenység szerint 3 csoportba sorolták. Míg a D. pulex a 2., a D. magna csak a harmadik csoportban kapott helyet (a már említett T. platyurus az első helyen végzett). A szabvány Daphnia teszt azért sem alkalmazható gyors reagálású jelzőrendszerként, mivel hosszú, 24-48 órás expozícióra van szükség. Mivel ismert, hogy több Microcystis törzs is kiválthatja vízibolhákban a táplálkozás (legelés) gátlását (pl. Henning et al„ 1991, Lotocka, 2001), azt vizsgáltuk, ez a kiváltott hatás mennyiben számszerűsíthető, a táplálkozás-aktivitás gátlásán alapuló teszt reprodukálható/ szabványosítható-e, és ehhez a Thamnocephalus platyurus vizsgálatán alapuló Rapidtoxkitben leírtak szerinti eredeti tesztprotokollhoz képest milyen módosítások szükségesek. 1 Rapid TOX néven ismert az American Bio Medica Corporation által forgalmazott, kábítószer kimutatására alkalmazott teszt is. 2. Anyag és módszer 2.1. Mintavétel, minta előkészítés Az elvégzett vizsgálatokhoz liofilizált Microcystis aeruginosa-t alkalmaztunk, ez Magyarországon a leggyakoribb cianobaktérium faj. A minták a következő helyről és időpontokból származtak: - Kis-Balaton Vízminőség-védelmi Rendszer (KBVR), Kazetta, 2005 - KBVR, Kazetta, 2006 A liofilizált algamintákból 4mg/ml töménységű törzsoldatot készítettünk desztillált víz felhasználásával, ebből 1:2:4:8:16 hígítású koncentrációsort állítottunk be. 2.2. Daphnia pulex táplálkozási-aktivitás gátlás teszt A MicroBioTests Inc.-tői szereztük be a tesztszervezeteket tartósított formában tartalmazó DAPHTOXKIT F™-et, amely a tesztszervezeteket tartóspete formájában tartalmazza. A peték keltetése a kitben található sóoldatok (NaHCOj, CaS0 4, MgS0 4, KCl) felhasználásával készült standard édesvízben történik. A teszt kivitelezése során a DAPHTOXKIT F™ elvégzéséhez használt mikroplate-eket használtuk, az egyes cellákat 5 ml mennyiségű tesztoldattal feltöltve. Kontroll oldatként a keltetés során használt standard édesvizet használtuk. Minden egyes cellába öt tesztszervezet került, és három párhuzamos mérést alkalmaztunk. A teszteket a Daphnia teszt esetében szabványos hőmérsékleten, 20°C-on végeztük. Az expozíciós idő 1,2 ill. 4 óra volt. Az expozíciós idő leteltével a tesztszervezeteket piros színű mikro-granulátummal etettük be (0,1 ml oldatba szuszpendálva), mely könnyen felismerhető a kisrák emésztőcsatornájában mikroszkóp segítségével. A piros színű etetőanyag megegyezett a Rapidtox tesztben alkalmazott anyaggal, beszerzési forrása szintén a MicroBioTests Inc. volt. Ezek után újabb fél órás inkubáció következett, amely után a tesztszervezeteket leöltük és külön erre a célra kialakított tárgylemezen (kék fényszűrő) vizsgáltuk a táplálkozási-aktivitás mértékét, azaz a mikro-granulátum jelenlétét a bélcsatornában. A normálisan táplálkozó/táplálékot nem felvevő egyedek akár szabad szemmel is elkülöníthetők egymástól. Az 1. kép olyan sztereomikroszkópos felvételt mutat be, amelyen piros mikroszemcséket előzetesen fogyasztott példányok láthatók. Az eredmények értékeléséhez százalékos formában fejeztük ki a toxikus hatást mutató (azaz nem táplálkozó) egyedek arányát. (Megjegyezzük, ez eltér az eredeti Rapidtoxkit protokolltól. Itt ugyanis a következő formulát kell alkalmazni: (A - B)/A x 100, ahol A a kontroliban táplálkozást mutatott egyed átlagos száma, B pedig az adott tesztoldatban megfigyelt piros tápcsatornájú egyedek száma. Az eredeti tesztprotokoll ugyanakkor azt is tartalmazza, hogy a teszt akkor érvényes, ha a kontroliban a lárvák legalább 50%-a mutatott táplálékfelvételt. A Rapidtoxkit tesztleírás szerint továbbá a 30%-os vagy ennél magasabb gátlás esetén tekinthetjük a mintát toxikusnak). Ez jelentősen eltér az általános ökotoxikológiai gyakorlattól, ahol a kontroliban 10 % gátlás ill. bármilyen megfigyelt hatás engedhető meg, a mintát pedig 20 %-os hatás felett tekinthetjük toxikusnak.
