Hidrológiai Közlöny 2006 (86. évfolyam)

6. szám - XLVII. Hidrobiológus Napok: Vizeink élővilágát érintő környezeti változások Tihany, 2005. október 5–7.

98 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2006. 86. ÉVF. 6. SZ. Diverzitás vizsgálatok kiskunsági és hortobágyi szikes vízterek nádasainak baktériumközösségein Rusznyák Anna, Borsodi Andrea, Márialigeti Károly ELTE Mikrobiológiai Tanszék; 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C Kivonat: 2004. áprilisában biofilm mintákat gyűjtöttünk a nádszárak tartósan víz alá merülő részéről a Kelemen-szék (Kiskunsági Nemzeti Park) és a Nagy-vadas-tó (Hortobágyi Nemzeti Park) területén. A mintákból többféle táptalajra szélesztettünk, majd összesen 260 törzset izoláltunk random módon. A hagyományos vizsgálatokba vont 164 baktériumtörzset fenotípusos tulajdonságaik alapján numerikus analízissel csoportosítottuk. A 16S rDNS szekvencia analízissel faji azonosításra kerülő csoportreprezentáns törzseket ARDRA mintázatuk összehasonlítását követően választottuk ki. A tenyésztésen alapuló vizsgálatok eredményeképpen Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Halomonas, Nesterenkonia, Paracoccus és Planococcus nemzetségbe tartozó baktériumokat identifikáltunk. A baktériumközösségek faji diverzitásának további elemzésére a mintákból tenyésztés nélkül közösségi DNS-t izoláltunk és 16S rDNS alapú klónkönyvtárat hoztunk létre. A 140 klónt ARDRA elemzésüket követően 45 csoportba soroltuk. A csoportreprezentáns klónok többsége ezidáig még tenyésztésbe nem vont baktérium klónokkal mutatott 93 és 99 % közötti hasonlóságot. A többi klón a Flavobacíerium, Sphingobacterium, Pseudomonas és Agrobacterium nemzetségek jelenlétére utalt. Kelemen-szék, Nagy-vadas-tó, biofilm baktériumok, klónkönyvtár, ARDRA, 16S rDNS szekvencia analízis MA algoritmus alapján végeztük. A numerikus analízist követően elvégeztük a kiválasztott reprezentatív törzsek ARDRA elemzését (Massol-Deya és mtsai, 1995). A pontos faji meghatározás érdekében a fenotípusosan és genotípusosan egyaránt elkülönülő csoportreprezentánsok 16S rDNS-ét parciálisan szekvenáltuk. A biofilm minták baktériumközösségeinek faji diverzitását klónozásos eljárással is vizsgáltuk. A közösségi DNS izolálás során fizikai (üveggyönggyel való rázatás sejtmalomban), valamint kémiai (Fast DNA* kit for Soil, Biol01" Systems, Q-BIOgene) sejtfeltáró eljárásokat kombináltunk. Az így nyert DNS-t a Geneclean® Spin kit (BiolOl® Systems, Q-BIOgene) segítségével tisztítottuk meg a kisebb DNS-daraboktól, RNS-től és egyéb, a PCR-t gátló anyagoktól. Klónozás céljára a Kelemen-székről származó biofilm minta közösségi DNS-ét sikerült PCR segítségével felszaporítani: a 16S rDNS régiót parciálisan, az E. coli 27-es és 519-es pozíciója között. A kapott PCR terméket megtisztítottuk (PCR-M™ Clean Up System kit, Viogene). A klónozáshoz a kék-fehér szelekción alapuló pGEM®-T Easy Vector System kitet (Promega) használtuk. Mivel a kék-fehér szelekció nem 100 %-osan megbízható, a klónkönyvtár screenelésekor először PCR reakció segítségével (Ml3 forward és reverz primerek, valamint az egyes klónok DNS-e, mint templát) ellenőriztük, hogy mely klónok tartalmazzák ténylegesen az általunk beklónozott inszertet. Az inszertet tartalmazó klónok PCR termékét használtuk templátként a következő PCR reakcióban, amelyben 27 forward és 519 reverz primereket alkalmaztunk. Az így kapott PCR termékeket ARDRA (HinóI, Alul enzimek) segítségével csoportokba soroltuk és a csoportokból egy-egy reprezentáns szekvencia-analízisét végeztük el. A nyilvános adatbázisban (GenBank) megtalálható legközelebbi rokon szekvenciákat BLAST program segítségével kerestük meg (

Altschul és mtsai, 1997). Eredmények és értékelésük A laboratóriumi körülmények között fenntartott 164 baktériumtörzset (84 törzs a Kelemen-székről, 80 a Nagy-vadas-tóról származott) hagyományos vizsgálatokba vontuk és 27 fenotípusos tulajdonság alapján numerikus analízissel csoportosítottuk. 80-90% közötti hasonlósági szinten 33, legalább két baktériumtörzsből álló csoportot sikerült elkülönítenünk. A számozott fenonokba 148 törzs (90,25 %) Kulcsszavak: Bevezetés A szikes élőhelyek Európa-szerte kiemelkedő jelentőségű természeti értéket képviselnek egyedülálló geológiai, hidrológiai, botanikai, zoológiai tulajdonságaiknak köszönhetően. A Kárpát-medence szikes tavaira - a világ egyéb sós vizeihez képest - a kisebb sótartalom, de a szódatartalom miatt az erős lúgosság jellemző. A sókoncentráció átlagosan 0,5-7,5 g f' értékek között ingadozik, de egyes tavakban a nyári bepárlódás során 70 g l"

1 is lehet. Sótartalom és lúgosság tekintetében a Kiskunság szikes vízterei jellemezhetők a legnagyobb értékekkel, a hortobágyi szikes mocsarak esetében ezek az értékek alacsonyabbak. A jellemző állományalkotó növényfaj mind a kiskunsági, mind a hortobágyi szikes vizes területeken a nád (Phragmites australis /Cav./ Trin et Steudel). A kiskunsági szikes mocsári vegetáció másik jellemző faja a zsióka (Bolboschoenus maritimus), ami a területeknek akár 40%át is boríthatja. A Hortobágy szikeseinek növényvilágát az egyre inkább terjeszkedő mocsári vegetáció jellemzi, de a lebegő és rögzült hínártársulások (köztük a zsiókások) is egyre nagyobb teret hódítanak (Boros, 1999). Vizsgálataink során a nád biofilm baktérium-közösségek faji összetételének feltérképezését tűztük ki célul, a mikrobiológiában használt módszerek szelektivitása miatt tenyésztésen alapuló klasszikus és tenyésztéstől független molekuláris biológiai módszerek alkalmazásával. Vizsgálati anyag és módszerek A Kelemen-szék (KB) és a Nagy-Vadas (KB) területén végeztünk mintavételezést 2004. áprilisában a nádszálak tartósan víz alá merülő részéről. A két mintavételi területről származó homogenizált biofilm mintákból higítási sorozatot készítettünk, és annak egyes tagjaiból az alábbi táptalajokra szélesztettünk: KingB (Cowan és Steel, 1974), DSMZ medium 246 (www.dsmz.de), alkalofil (Horikoshi, 1991) és oligotróf (Poindexter, 1991). A baktériumtörzsek fenotípusos tulajdonságait hagyományos tesztsorozatok segítségével vizsgáltuk. Az elsődleges csoportosítást SPSS szoftver segítségével, Simple Matching koefficiens alkalmazásával, UPG-