Hidrológiai Közlöny 2006 (86. évfolyam)
6. szám - XLVII. Hidrobiológus Napok: Vizeink élővilágát érintő környezeti változások Tihany, 2005. október 5–7.
73 A genetikai variabilitás generációk közti megoszlása a tiszavirágnál [Palingenia longicauda (Olivier, 1791)] Málnás Kristóf 1 - Zubor Ákos 2 - Lengyel Szabolcs 3 - Prokisch József 2 - Dévai György 1 'Debreceni Egyetem, TTK, Hidrobiológiái Tanszék, 4032. Debrecen, Egyetem tér 1. 2Debreceni Egyetem, ATC, Élelmiszer-tudományi és Minőségbiztosítási Tanszék, 4032. Debrecen, Böszörményi út 138. 3MTA-DE Evolúciógenetikai és Konzervációbiológiai Kutatócsoport, 4032. Debrecen, Egyetem tér 1. Kivonat: A tiszavirág (Palingenia longicauda) lárvái három évig tartó egyedfejlődéssel érik el a szubimágó, ill. az imágó állapotot, majd a rajzás és a tojásrakás után az adott generáció elpusztul. A generációk a faj életmenetéből következően nem fedik át egymást, s igy kicsi az esélye a generációk közötti génáramlásnak. Ha ez valóban így van, akkor elképzelhető, hogy még az egy helyen előforduló generációk között is genetikai különbségek vannak. Vizsgálatunkban ezt a hipotézist teszteljük egy felső-tiszai tiszavirágtelepről származó tiszaviráglárvák három korcsoportja közötti genetikai variabilitás megoszlásának tanulmányozásával. A vizsgálatot PCR technikával kombinált AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) módszerrel végeztük. Célunk a testméret alapján felállított, feltehetően egy-, két-, ill. hároméves (kirepülés előtti) lárvális korcsoport-kategóriák megalapozottságának, valamint a generációk közötti izoláció mértékének vizsgálata volt. Előzetes eredményeink szerint egyértelmű genetikai különbségek mutathatók ki a generációk, vagyis az azonos mérettartományba tartozó egyedek csoportjai között. Ezek szerint a generációk közti átfedés nem jelentős, s így elképzelhető, hogy a vizsgált tiszavirágtelepen a lárvák három egymástól időben izolálódott populációhoz tartoznak. Kulcsszavak: tiszavirág (Palingenia longicauda), szemivoltin életciklus, generációk, AFLP, genetikai variabilitás. Bevezetés riabilitás nagy felbontású, számos genetikai marker alapA tiszavirág hazánk és egyben Európa legnagyobb kéré- ján történő vizsgálatára ( Mueller és Wolfenbarger 1999). sze (Andrikovics és Turcsányi 2001). Egyedfejlődését és an- Anyag és módszer nak szakaszait nagyrészt már részletesen leírták (Andrikovics és Turcsányi 2001; Fink és Andrikovics 1997; Russev 1987; Soldan és Landa 1986; Landolt et al. 1997), de az esetleges alternatív fejlődési útvonalakat eddig még nem tanulmányozták populációs szinten. A tiszavirág egyike azon kevés vízi rovarjainknak, amelyek szemivoltin életciklusúak, azaz teljes kifejlődésük több évet vesz igénybe (Landa 1968; Hynes 1970; Sowa 1975). Ez a fejlődési típus lehetővé teszi, hogy egy adott élőhelyen párhuzamosan egyszerre több kohorsz (egyidős lárvák csoportja) is jelen legyen. Abban az esetben, ha a lárvális fejlődés rögzített, teljesen szabályosan folyik, az egy helyen található kohorszok közötti génáramlás lecsökken vagy megszűnik, s ebben az esetben genetikai izoláció alakulhat ki („elszigetelt kohorsz-hipotézis"). Ennek következtében - az azonos életfeltételek ellenére - idővel kimutatható genetikai eltérések alakulhatnak ki (Slatkin 1985). Ugyanakkor előfordulhatnak ún. „lyukas" kohorszok is ( Schultheis et al. 2002), ha generációnként bizonyos számú lárva nem három év alatt, hanem egy évvel korábban, vagy esetleg később éri el a teljes kifejlettséget. így ezeknek az egyedeknek a révén génáramlás folyhat a kohorszok között. A Palingeniidae család fajait három éves fejlődésű rovaroknak tartják, ami azon a megfigyelésen alapul, hogy a rajzás előtt a mederfalban található lárvákat testméret alapján három mérettartományba lehet csoportosítani. A fajt így az ún. C3-as fejlődési ciklusú kérészek (Landa 1968) közé sorolhatjuk, vagyis ivarérettségüket három éves fejlődés során érik el. Az elszigetelt kohorszhipotézis ellen szól, hogy a tiszavirág esetében bizonyos években megfigyelhetők „nagy rajzások", és ezek időpontjai nem mindig illeszthetők be a három éves periódusokba. Másrészt a lárvák kirepülése elnyújtott, több hullámban jelentkezik, és sokszor még akár augusztusban is lehet találkozni egy-egy „eltévedt" magányos példánnyal. Ezek alapján feltételezhető, hogy generációnként előfordulnak egyedek, melyek fejlődési ideje eltér a három éves ciklustól. Vizsgálatunkban az elszigetelt kohorsz-hipotézist genetikai módszerekkel ellenőriztük. A generációk közötti genetikai viszonyokat PCR technikával kombinált AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) eljárással vizsgáltuk. A módszer a DNS polimorfizmus vizsgálatának egyik lehetséges módja, s különösen alkalmas a fajon belüli genetikai vaA vizsgált lárvák a Felső-Tiszáról, a Gulács község közigazgatási területéhez tartozó Igonya nevű szakadó partról származnak. A mintavétel röviddel a rajzás előtt, 2004. június 25-27. között történt, vagyis abban az időszakban, amikor a lárvák korcsoportjai között a morfológiai eltérés a lehető legjobban érzékelhető. A korcsoportok elkülönítése a teljes testméret és a szárnyhüvelyek fejlettsége alapján történt. Ennek alapján 7 első éves, 8 második éves és 5 harmadik éves lárvával végeztük a vizsgálatot. A begyűjtött lárvákat a feldolgozás idejéig 96 %-os etil-alkoholban tároltuk. Az AFLP módszer azon az elven alapszik, hogy a teljes genomot adott szekvenciamintázat mentén restrikciós enzimekkel feldaraboljuk, így adott hosszúságú DNS töredékeket kapunk. Ezekhez a töredékekhez adaptereket kapcsolunk, és az adaptereknek megfelelő, de random végződésű primereket alkalmazva, PCR segítségével felszaporítjuk őket, majd kapilláris elektroforézissel elválasztjuk a töredékeket, s megkapjuk az AFLP mintázatot (Fos et al. 1995). A DNS kivonását Qiagen DNeasy Tissue Kit segítségével végeztük. A lárvákból származó DNS mintát EcoRI és Trull enzimekkel hasítottuk. Ezután a ligálás során az emésztett DNS fragmentjeihez kapcsoltuk a megfelelő adapter oligonukleotidokat. Az adapterekkel ligáit DNS fragmentumokat az adapterekhez tervezett speciális primerek használatával PCR segítségével szaporítottuk fel. Az első minták feldolgozása során túl nagy mennyiségű, ezért értékelhetetlen DNS töredék mintázatot kaptunk. Ezt a későbbiekben preszelektív PCR beiktatásával csökkentettük, ezáltal könnyebben kiértékelhető képeket kaptunk. A felszaporított DNS fragmenteket kapilláris elektroforézissel választottuk el. A kapott sávmintázatot bináris táblázatban ábrázoltuk, ahol 1-gyei jelöltük a jelenlévő és 0-val a hiányzó sávokat. A statisztikai feldolgozás során a csoportosítás helyességét diszkriminanci-aanalízissel, az egyedek közötti genetikai viszonyokat klaszteranalízis segítségével elemeztük, többféle hasonlósági index - Simple matching, Jaccard-index, euklideszi távolság - igénybevételével. Az elemzéshez SPSS 11.5 statisztikai programcsomagot használtunk.
