Hidrológiai Közlöny 2005 (85. évfolyam)

6. szám - XLVI. Hidrobiológus Napok: Szélsőséges körülmények hatása vizeink élővilágára, Magyarországi kisvízfolyások ökológiai viszonyai Tihany, 2004. október 6–8.

180 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2005. 85. ÉVF. 6. SZ. Adatgyűjtés a vízi baktériumok közvetlen, epifluoreszcens mikroszkópos számolásának új módszereiről 'Zsigó Krisztina, 'Tóth Adrienn, 2Vörös Lajos, 3Teszárné Nagy Mariann 'Debreceni Egyetem, Hidrobiológia Tanszék, 4032. Debrecen, Egyetem tér 1. 2Közép -Tisza vidéki Környezetvédelmi és Vízügyi Igazgatóság 5002, Szolnok, Pf.: 63. JMTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, 8237. Tihany, Klebeisberg K. u. 3. Kivonat: Tanulmányunkban, a baktériumok számának meghatározására alkalmas epifluoreszcens mikroszkópos módszereket hasonlítottuk össze, különböző hazai, természetes vizekből származó mintákon. A különböző fluorokrómokkal megfestett baktérium sejteket fekete polikarbonát filterre szűrtük s mennyiségüket közvetlen mikroszkópos számolással állapítottuk meg. Ökológiai vizsgálatokhoz a baktérium abundancia meghatározásának ez a módja kitűnő módszer. Teljesebb képet ad a baktériumok természetes eloszlásáról, mint az indirekt módszerek, hiszen így a mintavétel pillanatában a vízben előforduló összes élő és holt baktériumok száma megbecsülhető. Kulcsszavak: fluorokróm, Acridine Orange, DAPI, SYBR Green I, SYBR Green II, baktérium abundancia Bevezetés A baktériumok mennyiségének közvetlen mikroszkópos meghatározásával az ún. közvetlen baktériumszám (direct count) értéket kapjuk. Az indirekt módszerek alkalmazásakor valamilyen, a sejtszámmal szorosan összefüggő paramétert mérnek (pl. a telepszám esetén: csíraképes mikroorganizmusok számát) és ebből következtetnek a baktériumszámra. A közvetlen megfigyelési módszerek legfőbb előnye, hogy viszonylag egyszerűek és rövid időn belül kaphatunk eredményt. Azon baktériumsejtek is számolhatóak, amelyek a hagyományos módszerekkel nem mutathatóak ki, pl. nem vagy nehezen tenyészthető szervezetek (oligokarbofi! baktériumok). Megelőzhető továbbá a tenyésztéses módszereknél tapasztalható táptalaj-szelektivitás is. A természetes vizekben és üledékekben előforduló baktériumok kimutatására és mennyiségi meghatározására, jelenleg világszerte elterjedtek az epifluoreszcens mikroszkópos módszerek, amelyek különböző, sejtalkotókhoz kötődő fluorokrómok segítségével láthatóvá tett sejtek számolásán és mérésén alapulnak. A fluoreszcens festékek használata a korábban alkalmazott eljárásokkal szemben (például Razumov membránfilteres módszere) a következő előnyökkel jár: a festék a baktériumokhoz szelektívebben kötődik, így a mikrobák a szerves és szervetlen törmeléktől jobban elkülöníthetők; a vízi baktériumok mérete megközelítheti a fénymikroszkóp feloldóképességének határát, azonban a fluorokrómok fényemissziója miatt ezek a sejtek (sőt vírusok) mennyisége is kimutathatóvá válik. A fluoreszcens közvetlen számolási technikák elterjedésével folyamatosan újabb festékek jelennek meg a piacon, melyek kifejlesztését a különböző alkalmazások során felmerülő problémák (pl. háttérfluoreszcencia csökkentése, fading mérséklése, szelektív kötődés, nagyobb fényintenzitás a képelemző rendszerek használatakor stb.) indokolják. A legrégebben használt és Magyarországon legelterjedtebb fluorokróm az Acridine Orange (Hobbié et al., 1977). A másik széles körben alkalmazott festék a DAPI (Porter and Feig, 1980), amelyet szintén gyakran használnak a planktonikus baktériumszám és biomassza meghatározására, mivel képelemző rendszerrel is könnyen számolható és mérhető. A '90-es években jelentek meg az SYBR festékek, melyek közül az SYBR Green I or SYBR Green II-t (Noble and Fuhrman, 1998) használtuk. Ezeket főként PCR-technikában, flow citometriában, ritkábban vírusok és baktériumok közvetlen számolására alkalmazzák. Tanulmányunkban a kontinentális vízi baktériumok mennyiségének meghatározására leggyakrabban használt fluorokrómok hazai vizek vizsgálatánál történő alkalmazhatóságát vizsgáltuk. A vízminták különböző típusú állóvizekből és vízfolyásokból származtak. Az irodalomból ismert, hogy hiányosságainak ellenére is az acridine alapú fluorokrómok nyújtják a legjobban felhasználható becslést a baktériumok mennyiségéről. A hibák abból erednek, hogy csekély változtatások a módszertanban, már szignifikáns eltéréseket okozhatnak az eredményben, [pl. az átszűrt minta mennyisége, ill. a használt filter pórusnagysága (Jones J. G., Simon B. M., 1975)]. A különböző lebegő szerves és szervetlen részecskékben gazdag vizekben, ezen részecskék mennyiségétől és minőségétől függően nehézkes a baktériumsejtek számolása. A számlálni kívánt sejtek láthatósága, az elfedődés miatt a mikroszkópikus mezőben romlik (Clarke, K. R., Joint, I. R., 1986., Nakazato, R., Watanabe J. 1994.). Nakazato és Watanabe tavi üledékek baktériumainak esetében vizsgálták az epifluoreszcens számlálás hatékonyságát. Acridine Orange és DAPI festést használva, arra a megállapításra jutottak, hogy az Acridine Orange festés esetében a baktériumok nagyon nehezen voltak elkülöníthetőek a filteren fennmaradt szervetlen részecskéktől. A DAPI-val festett minták baktérium-száma a mesterségesen előállított ismert baktériummennyiséget tartalmazó mintákkal összehasonlítva kielégítő eredményt nyújtott. (Nakazato, R., Watanabe, I., 1994) M. G. Weinbauer és társai talaj- és üledékbaktériumok esetében vizsgálták számos fluoreszcens festék alkalmasságát közvetlen, mikroszkópos számoláshoz. Az összehasonlított fluorokrómok tesztelése során, melyek közt a jelen vizsgálatban szereplő négy festék is megtalálható volt a legjobb eredményt akkor értek el, amikor az SYBR Green II-t használták fluorokrómként aluminium oxid filtereken. A magas háttérfluoreszcencia és a nem elég specifikus kötődés miatt a tesztek 45%-ában a DAPI, és polikarbonát filter használata nem bizonyult alkalmasnak a baktériumszám megállapítására. (Weibauer, M. G., Beckmann, C., Höfle M. G., 1998.) Ráadásul a DAPI-val nem minden sejt festődik, ez a baktériumszám alulbecsléséhez vezethet. (Suzuki, M.T., E.B. Sherr, and B.F. Sherr. 1993. McNAMARA, C. J., Lemke M. J., Leff, L. G. 2003.) A sokféle víztípust felvonultató mintasorozat vizsgálata során a baktérium abundancia becslése mellett a minták klorofill-a tartalmát is meghatároztuk. Vizsgáltuk, hogy milyen kapcsolat van a bakterioplankton és fitoplankton abundancia között. Több kutatást is folytattak már ebben a témában, amelyek arra az eredményre vezettek, hogy a planktonikus baktérium-szám és a klorofill-a koncentráció közt tavakban pozitív korreláció áll fenn. (Koncz, E., V.-Balogh, K., Vörös L„ 1999.)