Hidrológiai Közlöny 2005 (85. évfolyam)
6. szám - XLVI. Hidrobiológus Napok: Szélsőséges körülmények hatása vizeink élővilágára, Magyarországi kisvízfolyások ökológiai viszonyai Tihany, 2004. október 6–8.
48 HIDROLÓGI AI KÖZLÖN Y 2005. 85. ÉVF. 6. SZ. változásokkal kapcsolatosan azonban ismereteink hiányosak. Vizsgálataink során kíváncsiak voltunk arra, hogy nehézfém - Cr(VI) - stressz hatására következnek -e be hasonló változások a szabályozó enzimek aktivitásában és a cukormintázat eloszlásában. Anyag és módszer Az algatáptalajhoz a Magyarországon kereskedelmi forgalomban kapható legnagyobb tisztaságú vegyszereket (alt.) használtuk fel. A szilárd táptalajhoz szükséges Bacto-agart a Difco Co.-tói (USA), az enzim-aktivitás mérésekhez, HPLC vizsgálatokhoz szükséges finomvegyszereket a Sigma Chemical Co.-tól (St. Louis USA) és a Merck Co.-tól (Darmstadt, Németország), Serva Fine Biochem. Gmbh. (Heidelberg, Németország) szereztük be. Vizsgálatainkhoz Chlorella pyrenoidosa (IAM-128) zöldalgát használtunk a Tokiói Egyetem Mikrobiológiai Tanszékének gyűjteményéből. Az algasejteket szilárd táptalajon tartottuk fenn a sterilitás megőrzésével. Az algasejteket 500 ml-es, speciális alganevelö edényekben tenyésztettük módosított C-30 folyékony, steril táptalajon 25 °C-on. A tápoldat összetétele: 2.02 g KNOj, 0.113 g KH 2P0 4, 0.087g K 2HP0 4, 0.24 g MgS0 4.7H 20, 0.037 g CaCl 2.6H 20, 1.0 g NaHCOj, 5 mg Fe (Fe 2 + -EDTA formában), 1.43 mg H3BO3, 0.905 mg MnCl 2.4H 20, 0.111 mg ZnS0„.7H 20, 0.0395 mg CuS0 4.5H 20, 0.0126 mg Na 2Mo0 4.2H 20, 0.0115 mg NH 4V0 3, 0.0245 mg Co(N0 3) 2.6H 20 ldm 3 oldatban. Az algákat, fehér, fluoreszcens fénnyel világítottuk meg (18 W/m ) és 5% C0 2 tartalmú, steril levegővel buborékoltattuk át, amely egyrészt szénforrásként szolgált, másrészt biztosította az alga szuszpenzió homogenitását és a pH-t 7.2 értéken (Simon et al. 2001). Vizsgálatainkhoz CdCl 2-ot, Cr(VI)-ként K 2Cr 2O 7-0t használtunk. A nehézfém-kezeléseket 72 órán át végeztük. Az összegyűjtött Chlorella pyrenoidosa sejteket desztillált vízzel mostuk, majd ismételt centrifugálás után azonnal felhasználtuk a kivonatok készítéséhez. Az alga-szuszpenziót hűtött dörzsmozsárban a megfelelő puffer és kvarchomok segítségével feltártuk. A sejttörmeléket centrifugálással távolítottuk el Janeczky K-24 centrifugában (30 perc 10.000 x g). Az így kapott felülúszót PEG-lal frakcionáltuk, majd az így kapott oldatokat használtuk az enzimaktivitás mérésekhez. A cukormeghatározást HPLC technikával végeztük, Sarasep Polymer H oszlopon, Shodex RI refraktív index detektorral. Eluens 0.01 n H 2S0 4 > 0,6 ml/sec sebességgel, 50°C-on. Az adatok kiértékelése Chromeleon kromatográfiás szoftverrel történt, a kalibrálást maltóz standardokkal végeztük. A keményítő meghatározást Rose módszerével végeztük (Rose et al. 1991) Foszfofruktokináz (PFK) és pirofoszfát-fruktóz-6-foszfát-foszfotranszferáz (PFP) részleges tisztításához a lemért algatCmeget pufferben (Tris-HCl 50 mM, pH 7.0, 10% glicerin, 1 mM EDTA, 28 mM ß-merkaptoetanol, 5 mM MgCl 2, 5 mM Pj 1:1 arányban feltártuk. A centrifugálás után kapott nyers kivonatot polietilénglikollal (PEG 6000) frakcionáltuk. Az így kapott részlegesen tisztított enzimeket használtuk az aktivitás mérésekhez, melyeket Kiss és mtsai. szerint végeztünk (Kiss et al. 1989). A fruktóz-1,6-biszfoszfatáz (FBP-áz) részleges tisztításához a lemért algatömeget pufferben (Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, 10 % glicerin, 1 mM EDTA, 28 mM ß-merkaptoetanol, 5 mM MgCl 2) 1:1 arányban feltártuk. A centrifugálás után kapott nyers kivonatot polietilénglikollal (PEG 6000) frakcionáltuk. A 13-25% PEG 6000 telítés között kicsapódott anyagot centrifugálás után minimális térfogatú pufferben visszaoldottuk. Az így kapott részlegesen tisztított enzimet használtuk az enzimaktivitás mérésekhez . Az enzim aktivitását kapcsolt enzimreakcióval határoztuk meg, a reakciórendszer a következő anyagokat tartalmazta: Tris-HCl, 50 mM pH 7.9, MgC! 2 2 mM, EDTA 1 mM, F1,6P 2 0.1 mM, NADP 1 mM, élesztő glükóz-ó-foszfát dehidrogenáz 8.5 nkat, élesztő foszfoglükóz izomeráz 8.5 nkat. A reakció előrehaladását a 340 nm-en mért abszorpcióváltozás alapján követtük nyomon (Hörcsik et al.1997). A cukor meghatározás 5, az enzim-aktivitás vizsgálat 3 párhuzamos mérés eredményein alapul. A fehérje-meghatározás Bradford módszerével (Bradford 1976) történt. Eredmények Az 1. táblázat a Cd-kezelt Chlorella pyrenoidosa sejtek szénhidrát mintázatának eloszlását láthatjuk 72 óra kezelés után. A kontrollcsoport adataihoz képest már a 0,1 mg/L koncentrációjú kezelésnél csökkenést figyelhetünk meg a szénhidrátok mennyiségében, illetve változást azok eloszlásában. A magasabb koncentrációk irányában a szénhidrátok mennyisége tovább csökken, különösen szembetűnő a keményítő mennyiségében bekövetkező csökkenés. A 2. táblázatban a Cr(VI)-kezelt Chlorella pyrenoidosa sejtekben beálló szénhidrát-anyagcsere metabolikus változásokat láthatjuk. A Cd-os kezeléssel kontrasztban a 0,1-1 mg/L koncentrációk esetében nem tapasztaltunk lényeges eltérést a mono és diszaharidok vonatkozásában, a fotoszintetikus vizsgálatok adatai alapján (Oláh et al. 2004) várható csökkenés csak a magasabb koncentrációknál jelenik meg. A keményítő mennyiségében már az 1 mg/L-es mintánál megindul a csökkenő tendencia (r = 0,884), ami a magasabb koncentrációk irányában tovább csökken (r = 0,948). Fotoszintetikus fluoreszcencia vizsgálataink alapján (Oláh et al. 2004), a szénhidrátok mennyiségének csökkenése volt várható. A Cd esetében ez a hatás már a legalacsonyabb alkalmazott koncentrációnál tapasztalható volt, Cr(VI) kezelésnél a ugyanez a hatás csak 5 mg/L koncentrációnál volt észlelhető. A kapott eredmények jó korrelációt mutatnak a többi toxicitási adattal - növekedési paraméterek, színanyag-mintázat - bár meg kell jegyezzük, hogy 1 mg/L Cr(VI) koncentrációnál jelentősebb csökkenést vártunk a szénhidrátok mennyiségében. Adataink alapján a Cd kezelésnél alacsonyabb koncentrációban is jelentős változás áll be Chlorella sejtek energiaforgalmában. Megvizsgáltuk szénhidrát-anyagcserét szabályozó enzimek működésében beállt változásokat. A 3. táblázat adatai a Cd kezelés hatására bekövetkező enzimaktivitás változásokat mutatják a PFK, PFP és FBP-áz enzimek aktivitásában. 5-10 mg/L koncentrációnál mindegyik enzim aktivitása jelentős mértékben csökken - ami valószínűleg, elsősorban a Cd-kezelésre bekövetkező lipidperoxidációra vezethető vissza (Milone et al. 2003). Alacsonyabb koncentrációk esetében a glikolítikus folyamatok szabályozásáért felelős enzimek - PFK, PFP - aktivitásában nem tapasztaltunk jelentős aktivitásváltozást, míg az ellentétes irányú glikoneogentikus folyamat szabályozásáért felelős FBP-áz aktivitása enyhe csökkenést mutat. A 4. táblázatban a Cr(VI) hatására bekövetkező enzimaktivitás változások láthatók. Bár a peroxidatív folyamatok mértéke kisebb - hasonló koncentrációk esetében - mint a Cd-nál (Hörcsik et al. 1997) 10 mg/L koncentrációnál mindegyik enzim esetében jelentős aktivitáscsökkenést tapasztaltunk. A Cd-hoz hasonlóan a PFK, PFP aktivitása alig vál-
