Hidrológiai Közlöny 2005 (85. évfolyam)
6. szám - XLVI. Hidrobiológus Napok: Szélsőséges körülmények hatása vizeink élővilágára, Magyarországi kisvízfolyások ökológiai viszonyai Tihany, 2004. október 6–8.
24 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 20 05 . 85 . ÉVF. 6. SZ. 72°C 10min). A DGGE futtatást 45-62 % közötti denaturáló (urea és fonnamid) gradiensű 6 %-os akriiamid gélben végeztük 60°C hőmérsékleten, 70V-on 18 órán át. A poliakrilamid gélek mintázatát a Phoredx ID (Nonlinear Dynamics) gélanalizáló szoftver segítségével elemeztük (sávazonosítás, dendrogrammok szerkesztése, hasonlósági index számítása). A kialakult mintázatokból UV fény megvilágítás mellett diszkrét csíkokat választottunk ki, melyeket a gélből kivágtunk, DNS tartalmukat eluáltuk és újabb PCR reakció segítségével amplifikáltuk. A reprezentatív törzsek, a klónok és a denaturáló gradiens gélből kivágott diszkrét csikók DNS-ének faji szintű azonosítását a 16S rDNS szekvencia analízisére alapozva végeztük, a kapott szekvenciák filogenetikai hovatartozását a BLAST internetes adatbázis és az ARB programcsomag segítségével ellenőriztük. Eredmények és értékelésük A tenyésztésen alapuló vizsgálatok során a Kelemenszék üledékéből a három különböző összetételű táptalajról összesen 119 baktériumtörzset izoláltunk. Közülük a fenotípusosan 90 %-nál nagyobb hasonlóságot mutató törzs-csoportokból reprezentánsokat választottunk a 16S rDNS szekvencia analízisen alapuló filogenetikai identifikáció céljára. A kiválasztott 22 baktériumtörzs kettő kivételével, melyek a y-Proteobacteria Halomonas nemzetségébe tartoztak, a Firmicutes kis G+C tartalmú Gram-pozitívok kőiébe nyert besorolást. Faji szinten (99-100 %-os szekvencia egyezéssel) két alkalitoleráns Bacillus faj, a Bacillus pumihis (2 törzs) és a Bacillus cereus (1 törzs) jelenlétét igazoltuk. A 16S rDNS klónkönyvtár feldolgozása során felszaporított 142 klónból 67-et csoportosítottunk ARDRA segítségével, majd elvégeztük az eltérő hasítási mintázatú eubakteriális klón fragmetumok szekvencia analízisét (/. táblázat) A tenyésztéssel nyert eredményekhez képest a klónkönyvtár feldolgozása sokkal szélesebb feji diverzitást eredményezett, a faji összetételben csak a y-Proteobacteria-nál találtunk egyezést A legtöbb klónszekvencia (67 %) a Proteobacteria törzsbe tartozott, de jelentós arányban (14 %) fordultak elő a Bacteroidetes törzshöz tartozó klónok is, míg további 5 filogenetikai törzs képviselői kisebb arányban (< 10 %) szintén jelen voltak a kelemen-széki üledékmintában. TT.ND III 1,11. m i i tN km *m a—(«»in* 94 MS 1. UMM (ARIX23) 90 M i,(*l»MM0 M 346 •t. «1 In«. ' • | J («mi m 3X5 11 -Si 1 IÉ 1 t\mjrr> n 347 O-^-iW«»! m 344 99 4» CAJOOM) 99 3W JtonurnKM (AÍU4042) 100 433 19 39• l(X) tt^HMHMn (XK23tt) M 410 Ha 111 l iá) H-w.iAntuw «3 l«3 " ' " H3 Aiiiiwi >• Mfwwi (AÄ7W55) M 192 ' »ei) MtM»ti>)VM (AYUTWC) « 391 »ei) 90 309 TÉ | ||| itt CAÄMMlJ) •4 211 /. táblázat A Kelemen-szék üledékmintáiból nyert 16S rDNS klónok gyakorisága és filogenetikai rokonsága Az 1. tábláját adataiból kitűnik, hogy a klónszekvenciák a hozzájuk legközelebbi rokonságban álló ismert baktériumfajokkal a •y-Proteobactena néhány jól tenyészthető képviselőjének a kivételével ( Pseudomonas és Serratia fajok) általában csak rövid (átlagosan 200-380 bp) szekvencia szakaszokon és/vagy meglehetősen alacsony (87-% %-os) hasonlóságot mutattak. A klónszekvenciákkal legközelebbi rokon baktériumfajok között az általunk is tenyésztésbe vont és fenotípusosan jellemzett, aerob kemoorganotróf heterotróf anyagcseréjü fajokon kívül (Szabó és mtsai, 2004) széleskörű és specifikus metabolikus aktivitás spektrummal jellemezhető, pl. aromás környezetszennyező vegyületek bontására is képes fajokkal rokon szekvenciákat (pl. Ralstonia basilensis) is találtunk. Kimutattunk aerob kemolitotróf autotróf kénoxidáló (Halothiobacilbis halophilus), nitrifikáló (Nitrospira moscoviensis) és metanotróf (Methylocaldum tepidum), továbbá anaerob bíbor (Rhodovibrio sodomensis) és zöld (Anaerolinea thermophila) nem kén fototróf, valamint denitrifikáló (Halomonas campisalis), illetve anaerob vas és kén légző (Pelobacter carbinolicus) anyagcseréjü baktériumokkal rokon szekvenciákat is. Ezeknek a baktériumfajoknak egy részét eredetileg a Kelemen-székhez hasonló alkalikus és/vagy sós tavi, ill. tengeri környezetekből izolálták (pl. Hahella, Oceanospirillum, Halothiobacillus), míg másokról (pl. Catellibacterium, Planctomyces és Cytophagá) ismert: rendkívül nehezen tenyészthető és különösen igényes fajok. í 1 1 r 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0.40 0.60 0.00 0.70 0.80 0.00 1.00 1. ábra. A Kiskunsági Nemzeti Park szikes tavainak üledékéből nyert bakteriális közösségi PCR termékek DGGE mintázatainak gélképe és a hasonlósági viszonyokat szemléltet ff UPGMA dendrogram
