Hidrológiai Közlöny 2005 (85. évfolyam)

6. szám - XLVI. Hidrobiológus Napok: Szélsőséges körülmények hatása vizeink élővilágára, Magyarországi kisvízfolyások ökológiai viszonyai Tihany, 2004. október 6–8.

16 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2005. 85. ÉVF. 6. SZ. Anyag és módszer Munkánk során az izraeli Kinneret-tóból 1994-ben gyűjtött toxikus Aphanizomenon ovalisporum törzzsel dolgoztunk. Az izolátum a Debreceni Egyetem Növénytani tanszékének törzsgyűjteményében BGSD423 jelöléssel szerepel. Tenyésztés: Az Aphanizomenon ovalisporum törzs fenntartására, illetve tenyésztésére egyszeres ásványianyag tartalmú Allen médiumot használtunk (Allen, 1968). A kénéheztetéshez késői exponenciális fázisig nevelt Aphanizomenon ovalisporum tenyészeteket centrifugáltuk, majd a sejtüledéket szulfátot nem tartalmazó tápoldatba oltottuk be, amelyben a szulfáttartalmú sókat ekvivalens mennyiségű kloriddal és nitráttal helyettesítettük. A törzs fenntartását fényen (max. 80 nmolm' V) rázatott, illetve levegővel buborékoltatott tenyészetek segítségével végeztük. Vizsgálatainkat steril levegővel buborékoltatott 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban, 400 ml kiindulási térfogatú tenyészetekben végeztük. A szárazanyag-tartalom meghatározása: A tenyészetekből naponta 3 ml mintát vettünk, a mintákat centrifugáltuk (7000 rpm, 3 perc), majd mosás után liofilizáltuk (fagyasztva szárítottuk). A klorofilltartalom meghatározása: A tenyészetek növekedését klorofill-a méréssel is (jig kl-a ml"

1) nyomon követtük. A klorofill meghatározása során a 663 nm-en, 80 %-os acetonban mért fényabszorpció alapján számítottuk a pigmenttartalmat (Bendall et al., 1988). A meghatározáshoz naponta egy alkalommal 200-200 |il mintát vettünk a tenyészetekből. A növekedésváltozásokat 14 napos időszak alatt követtük nyomon, az ettől idősebb tenyészetek stacioner kultúrának számítanak. A fehérjetartalom mérése: A fehérjetartalom meghatározásához napi három alkalommal 200-200 nl mintát vettünk a tenyészetekből. A sejtek feltárását háromszori fagyasztással értük el, a kivonatok fehérjetartalmát Bradford módszerrel határoztuk meg (Bradford, 1976). Enzimológiai vizsgálatok: Az ATP-szulfiiriláz enzim aktivitását a Lappartient és Touraine (1996) által leírt módszer módosításával mértük. Az enzimreakció során a reakcióelegyet (500 nl reakcióelegyben 80 mM Tris-HCl puffer pH=8,0; 7 mM MgCI

2; 0,2 mM Na

2ATP; 1 egység E. coli inorganikus pirofoszfatáz és 12 pl nyerskivonat) 37 °Con egy órán át inkubáltuk, majd a reakciót 100 jil 20%-os SDS hozzáadásával állítottuk le. A második lépésben az első reakció során felszabadult szervetlen foszfát (Pi) mennyiségét ammónium-molibdenátot tartalmazó komplexképző segítségével spektrofotometriásán határoztuk meg (Cooper, 1977). Az /. ábra a kénéheztetett Aphanizomenon ovalisporum tenyészet ATP-szulfiiriláz enzimének pH optimumát mutatja. Az alkalikus foszfatáz enzim aktivitását Ihlenfeldt és Gibson (1975) módszere szerint in situ mértük. 0.45« 0 2 4 6 8 10 12 14 PH /. ábra A kénéheztetett Aphanizomenon ovalisporum tenyészet ATPszulfuriláz enzimének pH optimuma. Eredmények A száraztömeg változása: A kontroll (S plus) tenyészet a szárazanyag-tartalom alapján exponenciális növekedést mutatott a tenyésztés teljes i^eje alatt. A tenyészet beoltásakor mért 0,7 mg-ml"

1 érték a 14. napra elérte a 6,3 mg ml"'-t (2a. ábra). A kénéhezés hatására a limitált (S minus) tenyészetben a száraz tömeg mindössze 0,3 mg-mal növekedett a 6. napig, ezt követően a tenyésztés végéig csökkenő tendenciát mutat a szárazanyag-tartalom. Irodalmi adatok szerint kénéhezés során a sejtek nagy mennyiségben halmozzák fel a rendelkezésre álló tápanyagokat. Az így létrejövő, a sejtek jelentős részét kitöltő tápanyagraktárak (cianoficin szemcsék, glikogén, polihidroxivajsav) magyarázatul szolgálhatnak az éhezés első felében megfigyelhető száraztömeg növekedésre (Arifio et al., 1995). A kénéhezés során megfigyelt száraz tömeg értékek messze elmaradnak a foszfátmentes (P minus) körülmények között tartott tenyészet esetében megfigyelttől (2b. ábra). Az Aphanizomenon ovalisporum sejtek - a cianobaktériumokra általánosan jellemző módon - képesek nagy mennyiségű foszfor felhalmozására (főként polifoszfát formájában), ilyen raktározási formák azonban a kén esetében nem figyelhetők meg, azaz a sejtek nem képesek a kén oly módon történő raktározására, mint az a foszfor kapcsán látható. Ezt támasztják alá a tenyésztés 48. órájában, szulfáttal kiegészített (S minplus) és a tenyésztés 48. órájában kénmentes táptalajba (S plusmin) átoltott tenyészetek adatai is. A 48 órán át kénéheztetett, majd szulfáttal kiegészített (S minplus) tenyészet esetében a tenyésztés teljes ideje alatt kénéheztetett (S minus) tenyészettel megegyező fejlődést figyelhettünk meg. A tenyészet a kén visszaadását követően növekedésnek indult, ami azonban a száraz tömeg változásában csak a 10. nap után mutatkozott meg markánsan (2a. ábra). A 48. óra után kénéheztetett (S plusmin) tenyészet növekedése az első 3-4 napban a kontrollal mutatott egyezést, de a kén megvonását követően szinte azonnal csökkent a növekedés sebessége (2a. ábra). A klorofill-a és a fehérjetartalom változása: A klorofill-a és a fehérjetartalom meghatározásának adatai alátámasztják a szárazanyagtartalom vizsgálata során megállapítható tendenciát, növekedési képet. Mind a klorofill-a, mind a fehérjetartalom változása azt mutatja, hogy az éheztetett tenyészet növekedése megállt. A tenyésztés 48. óráját követően, a szulfáttal kiegészített tenyészetben, mind a klorofill, mind a fehérje mennyisége növekedésnek indult, míg a kénmentes médiumba átoltott tenyészetben, a várakozásnak megfelelően csökkent (az adatokat nem mutatjuk be). 7n • Splus 8 10 12 14 16 kló (nap) 2a. ábra A száraz tömeg alakulása a kontroll (S plus), a kénéheztetett (S minus), a ként visszakapott (S minplus), és a tenyésztési idő 48. órájától kénéheztetett (S plusmin) Aphanizomenon ovalisporum tenyészetekben. 10 12 14 16 Id« (nap) 2b. ábra A száraz tömeg változása a kontroll (S, P plus), a kénéheztetett (S minus), és a foszforéheztetett (P minus) tenyészetekben. Az ATP-szuljuriláz enzim aktivitásának változása: A kontroll tenyészetben (S plus) az ATP-szulfüriláz aktivitása nem változott jelentősen a tenyésztés során (3. ábra). A szulfátéhezés (S minus) körülményei között az ATP-szulfiiriláz enzim aktivitása a tenyésztés első 56 órája alatt emelkedett, - az 56. órában, a kontroll értékhez képest az enzimaktivitás tizenhatszoros emelkedést mutatott (3. ábra). A 48 órán át kénéheztetett, majd szulfáttal kiegészített (S minplus) tenyészetben az enzimaktivitás változása a 48. óráig a szulfátéhezés körülményeinek megfelelő tendenciát mutatott. A kén (szulfát) visszaadása után, további kismértékű emelkedést követően, az enzimaktivitás gyorsan csökkent a tenyésztés végéig. A 48. óra után kénéheztetett (S plusmin) tenyészet ATP-szulfuriláz enzim aktivitás értékei, a tenyésztés első 48 órájában a kontroll tenyészetben mérhető értékekhez hasonlóan alakultak. A szulfátmentes médiumba történő átoltást követő 56 órán át az aktivitás emelkedett, ezt követően, az aktivitásértékek gyors csökkenése a tenyészet pusztulásával magyarázható (3. ábra). Elmondhatjuk, hogy a szulfát hiányában az ATP-szulfiiriláz enzim indukálódik a tenyészetben, majd - ha a szulfát nem válik újra hozzá-