Hidrológiai Közlöny 2005 (85. évfolyam)

5. szám - Sujbert László–Rácz Gergely–Szende Béla–Török Géza–Schrőder, Heinz-C.: Vízfertőtlenítési reakció melléktermékek (byproducts) genotoxikus hatásának vizsgálata az Ames-féle mutagenitási teszttel

26 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2005. 85. ÉVF. 5. SZ. csepegtettünk. Az utolsó vízminta frakció lecsöpögése után az oszlopokat négyszeres ágytérfogattal (= 4*95,50 ml) metilalkohollal és diklórmetánnal átmostuk. Az eluálás metanollal - poláros, nagyobb molekulasúlyú vegyületekhez és diklór-metánnal - illékony, kisebb molekulasúlyú vegyületekhez történt. Az oldószer frakciókat 50°C-on forgófilmes vákuum-desztillálóban (Rotadeszt) 10 ml-re pároltuk be. Üvegdugós üvegekben + 4°C-on tároltuk a feldolgozásig. A metilalkohol- és a diklór-metán frakció 10-10 ml oldataihoz n-hexánt mértünk, egy lezárható edénybe. Az oldatokat 30 percig kevertük mágnestű segítségével. A fázisok szétválása után az oldószeres fázist lepipettáztuk, az oldószerben levő vizet kifagyasztottuk. Az oldószert vákuum-desztillálással betöményítettük, n-hexánnal átöblített, lezárható kémcsőbe öntöttük. A végtérfogatot úgy állítottuk be, hogy az oldószert 0,50 ml-re nitrogén gáz befúvással töményítettük, végül a térfogatot n-hexánnal 1,00 ml-re egészítettük ki. Hígítások készítése Az n-hexános oldatokat egyesítettük, majd nitrogén gázzal légszárazra bepároltuk, a légszáraz maradékot dimetil-szulfoxid-ban oldottuk, és 2,00 ml törzsoldatot készítettünk. Ez a 2,00 ml törzsoldat 100 liter vízmintában lévő, gyantaoszlopokon adszorbeált anyagokat tartalmaz. Ebből az oldatból logaritmikus higítási sort készítettünk. A hígitási sorból 0,05-0,05 ml törzsoldatot mértünk a lemezekre. Ez a térfogat a vízminta 0,000,09-0,28-0,83-2,50 literének felel meg. Teszt törzsek TA-98 és TA-100 hisztidin auxotróf Salmonella typhimurium LT-2 mutáns törzsek. Teszt törzsek ellenőrzése: teszt törzsek genotipiáját Maron és Ames szerint ellenőriztük. Negatív kontroll: 0,05-0,05 ml dimetil-szulfoxid Pozitív kontroll: TA-98 és TA-100 teszter törzsnél +S9 mix aktiválás esetén 2ng/lemez 2-aminoantracént tettünk az elegybe. -S9 mix aktiválás nélkül: a TA-98 teszter törzsnél 2ng/lemez Nátrium-azidot , a TA-100 teszter törzsnél 4ng/lernez 4-Nitro-o-feniléndiamint használtunk. Sterilitási kontroll: Az ivóvízminta extraktumok legnagyobb dózisát, az S9-mixet, az extrakcióra használt oldószer légszáraz maradékának DMSOoldatát ("vak") a mutagenitási teszteléssel megegyezően eljárva sterilitásra ellenőrizzük. A vízminta extractum tesztelése (praeinkubációs teszt): 2-3 üveg kémcsőbe szobahőmérsékleten 0,500,50 ml S9 mixet (vagy puffert) 0,10-0,10 ml baktérium tenyészet szuszpenzót, 0,50-0,50 ml vízminta extractum dimetil-szulfoxidos hígítását (vagy oldószert) mértünk. Az elegyet 30 percig rázattuk 37°C-os vízfürdőben, majd szobahőmérsékleten 2,0-2,0 ml 45°C-os top agart mérünk a kémcsövekbe. A homogén elegyet minimai agar lemezre öntöttük, a táplemez felületén egyenletesen eloszlattuk. A top agar lemezeket a megdermedés után 37°C-on inkubáljuk 48-70 órán keresztül. A revertáns telepeket megszámoltuk Domino automata képanalizátorral (Perceptive Instruments Ltd., Halstead, Essex, UK). A háttérnövekedést tizes objektívvel ellenőrizzük. Az eredmények statisztikai-matematikai elemzése. A mérési adatok regressziós együtthatóját és regressziós állandóját a korrelációs együtthatóját, Studentféle kétoldalú t-próbát fx-7500G számológéppel számítottuk. A mutagenitási teszt értékelése. Pozitív mutagén aktivitásról akkor beszélhetünk egy vizsgált anyag esetében, ha: 1. A revertáns baktériumok száma legalább három egymást követő hígításban emelkedik. 2. A legkisebb hígításban a baktériumok száma a kontollhoz viszonyítva legalább a kétszeresére emelkedik. 3. Revertáns baktériumszám és a vízminta extraktum adagja a statisztikai matematikai összefüggés elemzés szerint: lineáris regressziót, korrelációt ad. A korrelációs együttható a Student-féle kétoldalú t-próbával számítva t-eloszlást mutat. 4. A vizsgálathoz használt teszter törzsek genotípusa megfelel Ames leírásának. 5. A vizsgálati vízminta steril. 6. A vizsgálati vízminta nem toxikus. Eredmények I. Kezeletlen vízminta mutagén aktivitásának eredménye A kezeletlen vízminta adag és a revertáns baktériumszám vizsgálati adatai Serdolit PAD III. gyantaoszlopon, A-98 és TA-100 teszter törzs esetén, aktiválás nélkül és aktiválással a 3. táblázatban láthatók. A mutagén aktivitás összefoglaló értékelése a TA-98 teszter törzsnél a 9. táblázatban és a TA-100 teszter törzsnél a 10. táblázatban szemlélhető. Az említett táblázatok adatai szerint a kezeletlen kútvíz a TA-98 teszter törzs esetén a Serdolit PAD III. gyantaoszlopon történt koncentrálással aktiválás nélkül, ill. aktiválással nem mutagén. A TA-100 teszter törzsnél azonban aktiválással mutagenitás mutatható ki. A revertáns baktériumszám és a vízminta adag között lineáris regressziós összefüggés, igen szoros korreláció van. A vízminták a pozitív mutagén aktivitás kritériumait kielégítik. A vízminta adag és a revertáns baktériumszám vizsgálati adatait Amberlite XAD-2 gyantaoszlopon a TA-98 és a TA-100 teszter törzseknél aktiválás nélkül és aktiválással a 2. és 4. táblázat tartalmazza. A mutagén aktivitás összefoglaló értékelését a TA-98 teszter törzsnél a 9. táblázatban mutatjuk be. Az említett táblázatok adatai szerint a kezeletlen kútvíz a TA-98 teszter törzsben Amberlite XAD-2 gyantaoszlopon történő koncentrálás után mutagén mind aktiválás nélkül, mind aktiválással. Serdolit PAD III. gyantaoszlopon történt koncentrálás után sem aktiválás nélkül, sem aktiválással sem mutatkozott mutagén hatás. A TA-100 teszter törzsben a vízminta azonban csak aktiválást követően indukált mutagenitást, mind Amberlite XAD-2, mind Serdolit PAD III. gyantaoszlopokon történt koncentrálást követően. A vízminta adag és a revertáns mutagén baktériumszám között lineáris regresszió, igen szoros korreláció van. A vízminták a pozitív mutagén aktivitás feltételeinek megfelelnek.