Hidrológiai Közlöny 2004 (84. évfolyam)

5-6. szám - XLV. Hidrobilógus Napok „Vizeink hosszú idejű változásai” Tihany, 2003. október 1–3.

51 tuk, majd 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM ß-merkaptoetanol, 14 % (v/v) glicerin tartalmú pufferoldatban, kvarchomok segítségével eldörzsöltük hűtött dörzsmozsárban. A mintákat Eppendorf centrifugában 6000 x g-vel 10 percig centrifugáltuk 4°C-on, az így kapott felülúszót használtuk az enzimaktivitások meghatározásához. Az enzireakció elegy 0.2 M Tris-HCl (pH 8.0), 1-50 mg/L Cr(VI), 10 mM ß-merkaptoetanolt és 200 pl nyers kivonatot tartalmazott 300 nl végtérfogatban. A mintákat 1 órán keresztül inkubáltuk 35°C-on , majd 30 pl 50%-os 5szulfoszalicilsawal állítottuk le a folyamatot. A proteineket jégen csaptuk ki 10 perc alatt. A fitokelatinokat LiChrospherlOO 250x4mm RP18 (5 pm) (Merck, Darmstadt, Németország) oszlopon választottuk el szobahőmérsékleten 1.5 ml/perc áramlási sebességet használva. A fitokelatinokat DTNB-vel kezeltük és 410 nmen detektáltuk UV/VIS detektorral (Chen és mtsai., 1997). A fehérje-meghatározást Bradford módszerével végeztük. Eredmények Vizsgálatainkban arra, voltunk kíváncsiak, hogy a Chlorella pyrenoidosa képes e akkumulálni a krómot, illetve az melyik sejtfrakcióban halmozódik fel. A medium krómtartalma felhalmozódik az alga sejtekben. Mint az 1. táblázat adataiból kitűnik a felvett króm zöme a sejtfalban, mintegy. 20 %-a azonban a membrán frakcióban, illetve a sejtplazmában immobilizálódik. Mérési eredményeink némileg eltérnek az irodalmi adatoktól (Okamura és mtsai. 1994). Az említett kutatócsoport - másik Chlorella fajban - háromnapos expozíció után a króm, mintegy 25 %-át találta a sejtfalban a roncsolt sejt mebrán-, citoplazma- és sejttörmelék frakcióiban pedig egyenlő arányban detektálta a maradékot. 1. táblázat Algasejtek és frakcionált algasejtek krómtartalma normál, illetve 1, 5,10 mg/l króm (VI) jelenlétében (Az adatok mg/l-ben vannak megadva) Analitikai adataink arra utalnak, hogy a táptalajban levő Cr(VI) a sejtekben már redukált formában található meg (Hörcsik és mtsai. 2002). A nehézfém stresszekre adott növényi válaszok egyik fontos eleme a fitokelatinok megjelenése. Magasabb rendű növényekben, algákban, gombákban is kimutatták. Bár elsődleges szerepe a nehézfém detoxifikálásban, csak a Cd esetében tekinthető bizonyítottnak. Mindemellett több esszenciális és toxikus nehézfém is induktorának bizonyult. Mindezidáig nem volt bizonyíték arra, hogy a króm indukálhatja a fitokelatinok szintézisét, Méréseinkben nem közvetlenül a megjelenő peptideket, hanem a fitokelatin-szintáz aktivitását vizsgáltuk. Mint az a 2. táblázatból is látszik a fitokelatin- szintáz aktivitása már a legalacsonyabb alkalmazott króm(VI) koncentráció esetében megnövekedik. Az időbeli lefutást tekintve a 6 és 12 órás mérések érdekes változást mutatnak. A 6 órás minták esetében enyhe növekedést tapasztalunk minden koncentráció esetében, mely ezután beáll egy állandó értékre. Az enzimaktivitás csúcsát az első nap végén éri el az enzim, majd a 3. napra lecsökken a kontroll szint, vagy az alatti értékre. Hasonló időbeli lefutás mintázat figyelhető meg kukorica gyökérben vizsgált fitokelatin-szintáz esetében is Cd stressz hatására (Szalai és mtsai. 2002). Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy a fitokelatinok gyorsan mobilizálható első védvonalként működnek a növényi sejtben nehézfém terhelések esetén, mely szerepet addig kell ellátniuk, míg lassabban reagáló, de kevésbé energiaigényes folyamatok átveszik a védekezési feladatokat. 2. táblázat Fitokelatin szintáz enzimaktivitás időbeli változása 0,5-10 mg/L Cr(VI) terhelés hatására Az adatok nkat/pg prot értékben vannak megadva 0 óra 1 óra 6 óra 12 óra 24 óra 72 óra kontroll 0,012 ±0,001 0,013 ±0,002 0,0145 ±0,0015 0,011 ±0,0015 0,0145 ±0,001 0,01 ±0,002 t B © 0,014 ±0,005 0,0125 ±0,0015 0,017 ±0,004 0,012 ±0,0015 0,029 ±0,001 0,013 ±0,004 lmg/L 0,013 ±0,001 0,012 ±0,001 0,013 ±0,0015 0,012 ±0,002 0,022 ±0,005 5mg/L 0,011 ±0,001 0,011 ±0,0015 0,012 ±0,0015 0,009 ±0,001 0,22 ±0,002 0,014 ±0,0005 1 • o 0,012 ±0,0015 0,011 ±0,002 0,009 ±0,002 0,010 ±0,001 0,019 ±0,001 0,014 ±0,004 A kutatás a Nyíregyházi Főiskola TTK TB. és az FKP03/2003 pályázat támogatásával történik. Irodalom Chen, ]., Goldsborough, P B. (1994) Increased activity of y-glytamilcysteine synthetase in tomato cells selected for cadmium tolerance Plant physiol. 106: 233-239 Chen

, J., Zhou.J., Goldsborough, P.B. (1997): Characterization of phytochelatin synthase from tomato. Physiol. Plant. 101: 165-172 Clemens, S., Kim, E.J., Neumann, D„ Schroeder, J.I., (1999) Tolerance to toxic metals by a gene family of phytochelatin synthases from plants and yeast. EMBO Journal 18: 3325-3333 Clemens, S., Schroeder, J.I., Degenkolb, T., (2001) Caenorhabdites elegans expresses functional phytochelatin synthase. Eur. Journal of Biochem. 268: 3640-3643 Howden, R„ Goldsbrough, P.B., Andersen, C.R., Cobbett, C.S. (1995) Cadmium-sensitive cadi, mutants of Arabidopsis thaliana are phytochelatin-deficient. Planr Physiol. 107: 1059-1067 Hörcsik, T. Zs, Balogh, Á. (2002) Intracellular distribution of chromium and toxicity on growth in Chlorella pyrenoidosa. Acta Biol. Szegediensis 46: 57-58. Klapheck, S., Fliegner, W„ Zimmer, I. (1994) Hydroximethyl phytochelatins (y-glutamylcisteine)„-serine are metal induced peptides of thePoaceae. Plant Physiol. 104: 1325-1332 Miensch, J., Tschimedbashir, M., Barlocher, F., Grams, Y., Pierau, B., Schierhorn, A., Kraus, G.J. (2001) Heavy metals and thiol Compounds in Mucor racemosus and Articulospora tatracladia. Mycol. Res. 105: 883-889 Okamura, H„ Aoyama, I. (1994) Interactive toxic effect and distribution of heavy metals in phytoplankton. Environ Toxicol and Water Quality 9:7-15 Oláh, V., Hörcsik , T. Zs., Cseke, G., Láposi R., Veres, Sz. Gáspár, A., Lakatos, Gy. Mészáros, (2003) A Cr(VI) hatása a Chlorella pyrenoidosa és a Lemna Gibba L. növekedésére és fotoszintetikus aktivitására. Hidrol. Közi. (2003) Jelen Kötet Szalai, G., Janda, T„ Golan-Goldhirsh, A., Páldi, E. (2002) Effect of Cd treatment on phytochelatin synthesis in maize. Acta Biologica Szegediensis 46: 121-122 Thumann, J., Grill, E„ Winnacker, E-L., Zcnk, M.H. (1991) Reactivation of metal-requiring apoenzymes by phytochelatin -metal complexes. FEBS Letters 284: 66-69 Kontrol lmg/L Cr(VI) 5mg/L Cr(VI) 10mg/L Cr(VI) Algasejt 0,2 17±1.8 28±3.6 24±3.8 Sejtfal 0,2 14.2.6 28.8±1.5 31 ±4.2 Membrán Nd 2.5±0.8 4.1±0.9 2.1 ±0.9 Citoplazma Nd 2.1±0.7 3.4±1.2 2.8±0.4