Hidrológiai Közlöny 2003 (83. évfolyam)

XLIV. Hidrobiológus Napok: "Ritkán vizsgált és különleges vizek" Tihany, 2002. október 2-4.

127 Velencei-tavi nád biofilm baktériumközösségek vizsgálata klaszszikus és molekuláris módszerekkel Rusznyák Anna

1, Borsodi Andrea

1, Vladár Péter

1, Molnár Piroska

1, Reskóné Nagy Mária

2, Ács Éva

3 'ELTE Mikrobiológiai Tanszék; 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C. 2K6zép-dunántúli Környezetvédelmi Felügyelőség; 8000. Székesfehérvár, Hosszúsétatér 1. 3MTA ÖBK1 Magyar Dunakutató Állomás, 2131. Göd, Jávorka Sándor u. 14. KHonatA nád biofilm baktériumközösségek megismerésére 2001. és 2002 júliusában mintavételezést végeztünk a Velencei-tó egészséges és pusztuló nádas állományainak területén A mintákból többféle, eltérő összetételű táptalajra szélesztettünk, majd összesen 479 törzset izoláltunk random módon. A hagyományos vizsgálatokba vont 251 baktériumtörzset fenotípusos tulajdonságaik alapján numerikus analízissel csoportosítottuk. A dendrogramon a csoportok szétválását elsősorban a baktériumtörzsek oxidatív, illetve femientatív anyagcseréje, illetve biopolimereket bontó képessége határozta meg. A 16S rDNS szekvencia analízissel faji azonosításra kerülő csoportreprezentáns törzseket ARD RA mintázatuk összehasonlítását követően választottuk ki. A tenyésztésen alapuló vizsgálatok eredményeképpen Bacillus, Aureobaclerium, Pseudomonas, Agrobacterium és az Aeromonas nemzetségbe tartozó baktériumokat identifikáltunk. A baktériumközössegek faji diverzitásának további elemzésére a mintákból közösségi DNS-t izoláltunk és a különböző fajokra jellemző szekvenciákat DGGE segítségévek különítettük cl Kulcsszavak: Velencei-tó, biofilm, baktériumtörzsek fenotipikus csoportosítása, ARDRA, 16S rDNS szekvencia analízis, [XXJE Bevezetés A különböző minták baktériumközösségeinek faji diverziA Velencei-tó Magyarország harmadik legnagyobb tava. tását a fentieken kívül egy a mikrobiális ökológia területén Legfontosabb növénytársulásai a parti régióban elhelyezkedő világszerte elteijedt módszer, a denaturáló gradiens gél eleknádasok (Scirpo-Phragmitetum), melyek domináns faja az Európában közönséges előfordulású nád (Phragmites australis Cav Trin ex Steudel). A tó és tágabb környezete életében a nádasok egyrészt víztisztító funkciójuk, másrészt trofikus kapcsolatokban játszott szerepük miatt nagyon jelentősek. Vízminőségvédelmi szerepüket nagymértékben növeli a nád és más vízinövények víz alatti részein kialakuló élőbevonat (Szabó és mtsai, 1993; Amann és mtsai, 1998). A nád biofilm szerkezetének és működésének ismerete az adott víztérben azért lényeges, mert felépítése és összetétele alapján jól elkülöníthetők a környezettanilag különböző élőhelyek, minőségének és mennyiségének alakulása pedig a vízminőségi állapotot, illetve annak megváltozását tükrözi (Costerton és mtsai, 1995; Lakatos és mtsai., 1998). Vizsgálatainkban ezért a biofilm létrehozásában és aktivitásában kiemelkedő szerepet betöltő baktérium-közösségek faji struktúrájának és metabolikus sajátságainak feltérképezését tűztük ki célul. Vizsgálati anyag és módszerek A Velencei-tó öt pontján [a Lángi-tisztás (L), a Némettisztás (N), az Agárd-Gárdony-Hosszútisztás (G), a Nádastó (K) és a Fürdető (F) területén] végeztünk mintavételezést 2001. és 2002. júliusában egészséges, illetve avas nádszálak tartósan víz alá merülő részéről. Három mintavételi területről (Lángi-tisztás, Agárd-Gárdony-Hosszútisztás és Fürdető) származó homogenizált mintákból hígítási sorozatot készítettünk, és annak egyes tagjaiból az alábbi táptalajokra szélesztettünk: KingB (Cowan és Steel, 1974), TSY (DSMZ Medium 92), alkalofil (Horikoshi, 1991) valamint oligotróf (Poindexter, 1991). A mintákhoz a következő jelzéseket használtuk: pl. LNA LNE a Lángi-tisztás avas, illetve egészséges nádfelszínéről származó minták esetében és ugyanígy a Gárdony GNA/GNE és a Fürdető FNA/FNE esetében. A tisztított baktériumtörzsek fenotípusos tulajdonságait hagyományos tesztsorozatok segítségével vizsgáltuk. Az elsődleges csoportosítást az SPSS szoftver segítségével, Simple Matching koefficiens alkalmazásával, UPGMA algoritmus alapján végeztük. A numerikus analízist követően elvégeztük a kiválasztott reprezentatív törzsek ARDRA analízisét (Massol-Deya és mtsai, 1995). A pontos faji meghatározás érdekében a fenotípusosan és genotípusosan egyaránt elkülönülő csoportreprezentánsok I6S rDNS-ét parciálisan szekvenáltuk. troforézis (DGGE) segítségével is vizsgáltuk (Muyzer és mtsai, 1993). Ennek során a közösségi DNS-ből PCR-rel felszaporított, közel azonos hosszúságú, de eltérő szekvenciájú 16S rDNS szakaszokat tartalmazó vegyes termékeket viszonylag magas hőmérsékleten (50-70°C), egy egyenletesen növekvő koncentrációjú denaturáló ágenseket (urea és formamid) tartalmazó poliaknlamid gélben futtattuk. Az egyes fajokra jellemző PCR termékek bázissorrendjüktől függően különböző koncentrációknál denaturálódtak és a mozgásuk a gélben lelassult. A megjelenő elektroforetikus csíkok száma így tehát a mintákban előforduló fajok számára utal. A módszer további előnye, hogy a szétválasztott, immár fajokra jellemző DNS a gélből visszanyerhető, és a szeventálást követően mód van a faj taxonómiai besorolására is (Muyzer és Smalla, 1998). Vizsgálataink során a mintákból közösségi DNS-t a BIO 101, Inc. FastDNA® Kit-jével izoláltunk. A DGGE fiittatásokhoz szükséges GC-farokkal rendelkező PCR termékeket minden esetben nested PCR reakciókban állítottunk elő. Az izolált teljes genomi DNS-ből Eubacteria-specifikus primer párok segítségével felszaporítottuk a bakteriális I6S rDNS egy nagyobb szakaszát (a 27-es és 1525-ös pozíció között a 27f-1525r primer párral). Ezt követően az előválogatott DNS fragmenteket PCR reakció segítségével, belsőbb primer párok alkalmazásával tovább dúsítottuk. Az ekkor alkalmazott primer pároknál a forward pnmer már GC-farokkal rendelkezett, hogy a denaturáló gélben optimálisan futtatható GC-farokkal rendelkező PCR termékeket kapjunk (GC-63f53 Ír primer párok). A fúttatáshoz akrilamidra 8 %-os, 40-70 % közötti denaturáló gradiensű gélt használtunk. A DGGE mintázatból kiválasztottunk négy diszkrét sávot, ezeket a gélből kivágtuk, a DNS tartalmukat eluáltuk és újabb PCR reakció segítségével amplifikáltuk. Az így kapott mintákat szekvencia analízisnek vetettük alá és eredményül teljesen tiszta szekvenciákat kaptunk, amelyeket a BLAST internetes adatbázis (Altschul, 1997) segítségével értékeltünk. Eredmények és értékelésük A hagyományos vizsgálatokba vont 251 baktériumtörzset 29 fenotípusos tulajdonság alapján numerikus analízissel csoportosítottuk (/. ábra). Ennek eredményeképpen 70-80 % közötti hasonlósági szinten 24, legalább két baktériumtörzsből álló csoportot különítettünk el. A számozott fenonokba 246 törzs (98 %) nyert besorolást. Csoportok közötti pozícióba öt törzs (a törzsek 2 %-a) került.