Hidrológiai Közlöny 2002 (82. évfolyam)

XLIII. Hidrobiológus Napok: "Vizeink ökológiai állapota: természetvédelem, vízhasznosítás" Tihany, 2001. október 3-5.

143 A cilindrospermopszin termelés analitikai vizsgálata Cylindrospermopsis raciborskii izolátumokban Vasas Gábor', Padisák Judit

2, Mikóné Hamvas Márta

3, Máthé Csaba

3, Molnár Erika

3, Surányi Gyula

3, Grigorszky István

3, Borbély György

3 'MTA DE Mikrobiológiai és Növénytani Kutatócsoport, 2 Veszprémi Egyetem, 8200. Veszprém, Pf. 158 'Debreceni Egyetem TTK Növénytani Tanszék, 4010. Debrecen, Egyetem tér 1. Kivonat: Aphanizomenon ovalisporum cianobaktérium törzsből tisztítottunk HPLC-DAD és azonosítottunk MALDI-TOF, NMR segítségével cilindrospermopszint. A cilindrospermopszin standard segítségével magyarországi, brazíliai valamint Ausztrál C. raciborskii izolátumok toxintartalmát határoztuk meg. A legmagasabb cilindrospermopszin tartalmat A. ovalisporumból mértünk (4mg/ml), valamint 2,5 mg/g toxintartalmat határoztunk meg az ausztrál izolátum esetében. A magyarországon izolált törzsek az általunk használt módszerekkel nem tartalmaznak kimutatható mennyiségben cilindrospermopszint. Cylindrospermopsis raciborskii, HPLC-DAD, cilindrospermopszin Kulcsszavak: Bevezetés Az utóbbi évtizedekben a „civilizáció tevékenységének" köszönhetően a felszíni vízterek szerves- és szervetlen anyag tartalmának felhalmozódása jelentős mértékben megnőtt, s ennek következtében eutrofizációs folyamatok indultak és indulnak el (Reynolds, 1975). Világszerte ismert jelenség, hogy az ilyen eutróf vizekben toxintermelő cianobaktériumok szaporodhatnak el, vízvirágzást idézhetnek elő (Carmichael, 1994). Az utóbbi években egyre több kontinens víztereiben jelent meg a Cylindrospermopsis raciborskii (C. raciborskii.) cianobaktérium faj és okozott vízvirágzást (Padisák, 1997, Vörös, nem publikált adat). A faj toxintermelésére jellemző, hogy egyes izolátumaik termelik a cilindrospermopszin nevezetű cianotoxint, míg más izolátumok esetében saxitoxin analógokat mutattak ki, illteve több jelentés ismeretes cianotoxint nem termelő izolátumokról (Sivonen, 1999). Munkánkban magyarországi, brazíliai valamint ausztráliai C raciborskii izolátumok cilindrospermopszin termelését vizsgáltuk meg illetve hasonlítottuk össze a cilindrospermopszint termelő Aphanizomenon ovalisporum cianotoxintartalmával. Anyag és módszer Munkánk során a Kineret tóból (izrael) származó cilindrospermopszint termelő Aphanizomenon ovalisporumot, Ausztráliából származó két C. raciborskii, valamint az általunk izolált három magyarországi és egy brazíliai C. raciborskii izolátum cilindrospermopszin tartalmát vizsgáltuk meg. HPLC: A HPLC-s analíziseket, diódasoros UV-VIS detektorral ellátott Shimadzu LC-10AD vp-n folytattuk A HPLC-oszlop Supelco SupercosirSPLC-18 (25 x 10 mm, 5 jim), az eluens Me0H/H

20. NMR: Az 'H ,

3C NMR-vizsglatokat Bruker DRX-500 készülékkel 500.13/125.79 MHz-envégeztük a DE, TTK NMR laboratóriumában. ID 'H-NMR spectrum felvétele deuterált vízben (D

20), 298K hőmérsékleten történt Shigemi küvettában (250 jil). A kétdimenziós HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation) spektrum identikus 'H/"C eredményt adott. MALD1 TOF: MALDI-TOF MS analízist pozitív-ion módban a Bruker Biflex MALDI-TOF tömegspektrométerTel folytattuk. A minta deszorpció/ionizációja 337 nm-en nitrogén lézerrel történt. A műszer kalibrálását malto-oligosacharid [M+Na]* csúcsaival végeztük (m/z: 527 15,689 21,851.26, 1013.31 and 1 175.36) A spektrumot 2,5-dihidroxibenzoe sav (DHB) matrixban vettük föl (0.5 jil matrix oldatot 0.5 Hl mintával szobahőmérsékleten szárítottuk be). A DHB mátrix (10 mg) DHB-t tartalmazott (0.5 ml) etanol:vlz (l:l/v:v) elegyében. A liofilezett analizálandó mintát vízben vettük fel, az identifikált mintánk báziscsúcsa az [M+H]* csúcs. Eredmények Az A. ovalisporum metanolos kivonatát analizáltuk HPLC-DAD-al, majd a csúcsok spektrumainak elemzése után a 11 perc retenciós idejű csúcsot összegyűjtöttük. Az anyag UV (Xmax: 262) spektruma és MALDI TOF spektruma (m:416,5) alapján azonosítottuk, és az NMR spektrum segítségével meghatároztuk az ismeretlen anyag szerkezeti képletét. Az NMR adatok azonosak voltak Othani és munkatársai (Ohtani, 1992) által közölt adatokkal. Az általunk HPLC-DAD-al megtisztított és modem szerkezetazonosltó műszerekkel meghatározott anyag, a N-tartalmú uracilszármazék, a cilindrospermopszin volt (1 ábra) A feltárt sejtek metanolos kivonatát HPLC-vel analizáltuk, és cilindrospermopszin standarddal készített kalibrációs görbe segítségével meghatároztuk a cilindrospermopszin tartalmukat (/ .táblázat). Eredményeink alapján elmondható, hogy a legnagyobb cilindrospermopszin tartalmat az A. ovalisporumból sikerült kimutatnunk (4 mg/g), illetve jelentős cilindrospermopszin tartalmat mértünk az Ausztráliából származó AQS izolátum esetében (2 mg/g). Az általunk vizsgált többi C. raciborskii izolátumokban cilindrospermopszint analizálható mennyiségben nem tudtunk kimutatni. Eredményeink alapján elmondható, hogy a legnagyobb cilindrospermopszin tartalmat az A. ovalisporumból sikerült kimutatnunk (4 mg/g), illetve jelentős cilindrospermopszin tartalmat mértünk az Ausztráliából származó AQS izolátum esetében (2 mg/g). Az általunk vizsgált többi C. raciborskii izolátumokban cilindrospermopszint analizálható mennyiségben nem tudtunk kimutatni. Eredményeink alapján elmondható, hogy a legnagyobb cilindrospermopszin tartalmat az A. ovalisporumból sikerült kimutatnunk (4 mg/g), illetve jelentős cilindrospermopszin tartalmat mértünk az Ausztráliából származó AQS izolátum esetében (2 mg/g). Az általunk vizsgált többi C. raciborskii izolátumokban cilindrospermopszint analizálható mennyiségben nem tudtunk kimutatni. 1. táblázat: A Cylindrospermopsis raciborskii izolátumok cilindrospermopszin tartalma Izolátum Törzs származási helye Cilindrospermopszin tartalom BGSD 423 A. ovalisporum Kineret tó (Izrael) 4 mg/g BGSD 266 C. raciborskii Balaton (1995) Nem detektálható BGSD 2000 C. raciborskii Balaton (2000) Nem detektálható BGSD 280 C. raciborskii Szelidi tó Nem detektálható BGSD323 C. raciborskii Nova Avanhandava (Brazília) Nem detektálható AQS C. raciborskii Ausztrália 2,5 mg/g LT C. raciborskii Ausztrália Nem detektálható Magyarországi izolátumaink BGSD-280 (Szelidi tó), BGSD-266 (Balaton), BGSD-2000 (Balaton) cilindrospermopszin analízise kiemelt jelentősséggel blr hiszen hazai cianobakteriális tömegprodukciók toxinanalízisei gyakran ellentmondásos eredményeket adnak. A vizsgált magyarországi izolátumok esetében elmondható, hogy a tudományos irodalom által leírt és ismert cilindrospermopszint nem tartalmazzák detektálható mennyiségben. Köszönetnyilvánítás: A kutatómunka feltételeinek megteremtéséért köszönjük az OTKA T22988 és T9235 számú pályázatok támogatását. Irodalom Carmichael, W.W. (1994) The toxins of Cyanobacteria. Scientific American. January 64-72. Ohtani, I., Moore, R.E. and Runnegar, M.T.C. (1992) Cylindrospermopsin: a potent hepatotoxin from the blue-green alga Cylindrospermopsis raciborskii. J. Am. Chem. Soc. 114, 7941-7942 Padisák, J. (1997) Cylindrospermopsis raciborskii (Woloszynska) Seenay;« et Subba Raju, an expanding, highly adaptive cyanobacterium: worldwide distribution and review of its ecology. Arch. Hydrobiol./Suppl. 107, 563-593. Reynolds, C.S. and Walsby, A.E. (1975) Water-blooms. Biol. Rev. 50, 437481. Sivonen, K and Jones, G. (1999) Cyanobacterial toxins, In Toxic cyanobacteria in water. A guide to their public health consequences, monitoring and management, (Chorus, I. and Bartram, J. Eds ), pp 41-111, E &FN Spon, London and New York.