Hidrológiai Közlöny 2001 (81. évfolyam)
5-6. szám - XLII. Hidrobiológus Napok: „A magyar hidrobiológia időszerű kérdései az ezredfordulón” Tihany, 2000. október 4–6.
484. HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2001. 81. ÉVF. 5-6. SZ. Algák mennyiségének in vitro és in vivo meghatározása fluorimetriás módszerrel Tálos András 1 - Vörös Lajos 2 'Veszprémi Egyetem, Veszprém, 2MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, Tihany Kivonat: Spektrofotométerrel és fluoreszcens spektrofotométerrel történő in vitro klorofill-a koncentráció meghatározást hasonlítottuk össze. Ez utóbbi módszer előnyeit - mint a két nagyságrenddel való érzékenysége és a klorofill bomlástermékek kisebb mértékű zavaró hatása - eredményeink is alátámasztják. Az algák in vivo fluoreszcencia gerjesztési spektrumai alapján természetes fitoplankton együttesek taxonómiai szintű elemzésére szolgáló eljárást dolgoztunk ki. Kulcsszavak: klorofill-a, feopígmentek, fluorimetria, fitoplankton összetétel. Bevezetés A vízi elsődleges termelésben alapvető szerepet játszó planktonikus vagy rögzült életmódú algák mennyiségének (tömegének) becslésére alkalmas a klorofill-a víztérfogatvagy felületegységre vonatkoztatott mennyiségének meghatározása. A felszíni vizek trofitásának jellemzésére a klorofill-a mérések eredményeit használják fel leggyakrabban. A növényi pigmentek meghatározásával nem csak a fitoplankton mennyisége jellemezhető, hanem az algák különféle rendszertani csoportjainak jellegzetes pigment mintázata alapján a fitoplankton minőségi összetételére is következtethetünk (Szilágyi 1983). A klorofill-a minden algára jellemző, valamennyi növényi pigment közül a legfontosabb, mivel központi helyet foglal el a fotoszintetikus elektrontranszport láncban. A planktonikus algák klorofill-a tartalma és biomasszája között viszonylag szoros összefüggés van, ezen összefüggés együtthatói azonban különböző vizekben nagymértékben eltérhetnek. A klorofill-a mérés különösen akkor előnyös, amikor nagy tömegű adatra van szükség a trofitás tér- és időbeli változásának megállapítása céljából, és akkor, amikor a hirtelen fellépő vízminőség változás gyors beavatkozást igényel. Hazánkban széles körben elteijedt és szinte kizárólagosan használt spektrofotometriás eljárás mellett egyre inkább teret nyer a fluorimetriás módszer. Munkánkkal ez utóbbi eljárás elterjedését szeretnénk elősegíteni, annak számos előnyös tulajdonsága alapján. In vitro klorofill-a meghatározás A méréshez referenciaanyagként ismert mennyiségű, tiszta klorofill-a-t (Sigma) használtunk, amelyet 90 %-os metanolban oldottunk fel. Ebből a törzsoldatból készítettünk több nagyságrendet átölelő, ismert koncentrációjú hígítási sort (10000 ng r'-től 0,076 pg r'-ig), majd mértük a klorofill-a oldatok abszorbanciáját Shimadzu UV-VIS 160A spektrofotométerrel (666 nm-en, 1 cm-es küvettában), és a fluoreszcencia intenzitásukat, Hitachi F-4500 fluoreszcens spektrofotométerrel (geijesztés 435 nm, emisszió 670 nm). Az abszorbancia és a tiszta klorofill-a koncentráció között linearis összefüggést kaptunk az alkalmazott koncentráció tartományban. Ezzel szemben a fluoreszcencia intenzitás és a tiszta klorofill-a koncentráció között csak alacsony klorofill-a koncentrációnál volt az összefüggést lineáris (40 pg l'-ig). Ezért két kalibrációs görbét készítettünk, egyet alacsony (0,08-40 pg 1* ), és egy másikat magas klorofill-a koncentráció (40 - 1250 pg I*) tartományban. Alacsony koncentrációnál a fluoreszcens spektrofotométer beállítási paraméterei a következők voltak: geijesztés 435 nm, emisszió 670 nm, rés Ex/Em = lOnm/lOnm, PMT: 700 V. Magas koncentrációnál az összefüggés másodfokú egyenlettel közelíthető és a fluoreszcens spektrofotométer paraméterei a következők voltak: gerjesztés 435 nm, emisszió 670 nm, rés Ex/Em = 5 nm/ 5 nm, PMT: 700 V. Az említett kalibráció csak a bomlástermékektől mentes tiszta klorofill-a oldat esetén érvényes, azonban a természetben több-kevesebb bomlástermék mindig előfordul (feopigmentek), melyek zavaróan hatnak a klorofill meghatározásra Ezt a zavaró hatást a spektrofotometriás eljárásnál a hazai gyakorlatban rendszerint figyelmen kívül hagyják (Felföldy 1987, Németh 1998), amely esetenként (pl. üledék minta) jelentős klorofill-a koncentráció felülbecslést okozhat. A klorofill-bomlástermékek a klorofill-a mérés hullámhossz tartományában fényt nyelnek el, ami a fotoszintetikusán aktív klorofill-a koncentráció felülbecslését eredményezi. Ezt a hibát küszöböli ki az ún. savazásos módszer (Lorenzen 1967, Tett etal. 1975). Ezt az eljárást követve adott klorofill-a koncentrációjú oldat abszorbanciáját és fluoreszcencia intenzitását mértük savazás előtt illetve savazás után. Savazáshoz 1 N sósav oldatot használtunk, 1 ml klorofill-a oldathoz 10 (il sósav oldatot adtunk, majd az oldatot alaposan összekevertük és 5 percig sötétben tartottuk. Azonos koncentrációjú klorofill-a oldat esetén, amíg az abszorbancia felére, addig ugyanannál az oldatnál a fluoreszcencia intenzitás ötödére csökkent (/. ábra) következésképpen a feofitin zavaró hatása a fluoreszcens módszer esetén jelentősen kisebb, így ez utóbbi módszer pontosabb klorofill becslést eredményez. 0 30 n E » to 1 Sf § • AlMiortOTda *a Imiumioi Abazortianda imili uun Fluoraucanda Haratta aavazia btfanzjua Mvuia Ma (Uoro«-a) (fwttn) uttn (laoMn) 1. ábra. Savazás hatására bekövetkezett abszorbancia ilL fluoreszcencia intenzitás csökkenés 'in vitro' spektrofotometriás és fluoreszcens spekrofotometriás klorofill-a koncentráció meghatározásnál A fent leírt kalibrációval történő klorofill-a koncentráció meghatározás mellett a savazásos módszerrel megállapítható az adott minta feopigment koncentrációja is. Ez esetben először a savazás előtt, majd a savazást követően méijük a minta fluoreszcencia intenzitását és a következő összefüggésekkel számítjuk a klorofill-a és a feopigmentek koncentrációj át ( Wetzel and Likens 1991).
