Hidrológiai Közlöny 2000 (80. évfolyam)
5-6. szám - XLI. Hidrobiológus Napok: "Vízi ökoszisztémák (taxonómia, biodíverzitás, biomonitorozás, élőhelyek frakmentációja, inváziós fajok biológiája)" Tihany, 1999 október 6-8.
394 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2000. 80. ÉVF. 5. SZ. Cianotoxinok kimutatása mustár csíranövény teszttel (BGST) a Cylindrospermopsis raciborskii cianobaktériumból Vasas G.,. M-Hamvas M,. Máthé Cs,. Molnár E,. Grigorszky I., Borbély Gy Kossuth Lajos Tudományegyetem Növénytani Tanszék, 4010. Debrecen, Egyetem tér 1. Kivonat: Potenciálisan toxikus Cylindrospermopsis raciborskii izoláltumokat (törzseket) teszteltünk mustár csiranövény teszttel. Izolátumaink a Balatonból (BGSD 266), a Szelídi tóból 1(BGSD 280) valamint a brazíliai Nova Avanhandava (BGSD 323) víztározóból származtak Izolátumaink a tesztelés során toxikusnak minősültek. A balatoni cianobaktérium törzsből izolátumból módosított növényteszt segítségével több, a növényi anyagcserét gátló anyagcsereterméket mutattunk ki. Kulcsszavak:.: Cylindrospermopsis raciborskii, cianotoxin, mustár csíranövény. Bevezetés steril mustármagot vetettünk 3-5 ismétlésben. A növényeket 25°C-os termosztátban négy-öt napig sötétben neveltük. A növények teljes hoszszát, a gyökérzet és a hypocotil hosszát mértük és mm-ben, vagy a kontrollhoz viszonyított %-os növekedés gátlás arányban adtuk meg. A terepi és laboratóriumi minták nagy számára való tekintettel egy módosított csíranövény-teszlet alkalmazunk, amelyet Titertech® lemezen hajtottunk végre. A Titertech lemez lehetővé teszi, hogy egyszerre nagyszámú mintát kellő ismétlésben vizsgálhattunk. A szervezetek toxicitását, toxikológiai tesztelés után ú.n. IC» (50 %-os növekedés gátlás) értékkel jellemeztük A 20-25 napos (2g/l) Cylindrospermopsis raciborskii BGSD 262 5 l-es tenyészet 8500 rpm-en Beckman centrifugával 5 percig centrifugáltuk JA-10-es rotorban. A sejtüledéket összegyűjtöttük, majd -20°C-on fagyasztottuk két alkalommal. A feltárt sejteket 50%-os metanollal extraháltuk, majd bepárlás után 50%-os etanolba feloldottuk. Az oldatunkat TOYOPEARL HW-40-es 50%-os etilalkohollal equilibrált molekulaszűrőn kromatografáltuk Világszerte ismert jelenség, hogy eutrof vízterekben cianobaktériumok tömegesen elszaporodhatnak, vízvirágzást idéznek elő (Reynolds, 1975). Toxintermelő cianobaktériumok nagyszámú megjelenése gyakran előidézi a házi- és vadállatok pusztulását, és szórványosan emberi megbetegedéseket is okozhat (Carmichael, 1989). A világ szinte minden tájáról vannak feljegyzéseink olyan emberi megbetegedésekről illetve állati elhalálozásokról, amelyek cianotoxinokkal kapcsolatba hozhatóak ( Bell et al, 1994) Az első tudományos leírás amely feltehetően cianotoxin-mérgezésről szól több mint száz éves, és a dél-ausztráliai Alexandrina tó körüli elpusztult kutyákról, macskákról, bárányokról, lovakról és disznókról szól. Az állatok pusztulását a brakvizi Nodularia spumigenia nevű toxikus cianobaktérium okozta (Carmichael, 1994). A nemzetközi közvélemény (a köznapi és a tudományos) egy ausztráliai vízvirágzás során figyelt fel a Cylindrospermopsis raciborskii nevű cianobaktérium fajra. 1979 novemberében Palm Island-en, észak Queensland-ben (Ausztrália) 148 gyermek került súlyos hányásos, kiszáradásos tünetekkel kórházba, mert a Cylindrospermopsis raciborskii belekerült a vízvezeték hálózatba. A fáj egy Solomon Dam nevű ivóvíztározóban idézett elő vízvirágzást, és hogy a vízvirágzást megszüntessék, a vizet rézszulfáttal kezelték Ennek hatására kerültek az ivóvízbe a sejtek anyagcseretermékei, így a cilindrospermopszin nevű cianotoxin is (Hawkins et al, 1985). Munkánkban különböző eredetű Cylindrospermopsis raciborskii törzsek toxicitását vizsgáltuk mustár csíranövény teszttel. Izolátumaink a Balatonból (BGSD 266), a Szelídi tóból (BGSD280) valamint a brazíliai Nova avanhandava (BGSD323) víztározóból származtak. A balatoni törzsből a módosított növényteszl segítségével több, a növényre gátló anyagcsere terméket mutattunk ki Anyag és módszer A toxikus algák vizsgálata során bevált általános tapasztalat, hogy az adott toxikus vízvirágzást okozó cianobaktériumot izolálják és laboratóriumi körülmények között tesztelik toxicitását Természetben gyűjtött mintákból az élő szervezetek izolálása céljából Packard szcintillációs üveg küvettákba részmintákat vettünk és a toxikológiai tesztekhez a víz felszínére felúszó „algatömegből" is mintákat vettünk („plankton-minta"). A cianobaktériumok, valamint eukarióta algák tenyésztése során általánosságban bevált a BG-11 és Allen tápoldat használata (/illen, 1968). Az algaizolálást hígitásos módszerrel Allen valamint BG-1 l-es tápoldatokat tartalmazó folyadék- és agarral szilárdított táptalajon végezzük a monocianobakteriális kultúrák létrehozásáig. A törzsek fenntartását fényen (max. 35-100 pmol m' 2 s"'), rázatott illetve levegővel buborékoltatott tenyészetek segítségével végeztük A rázatott tenyészetek 100-300 ml-es Erlenmayer lombikokban, a buborekoltatottak 1-10 literes lombikokban nőttek, melyeket sterilre szúrt levegővel buborékoltattunk, megoldva így a tenyészetek keverését is. A rázatást Brunswick típusú rázógépen (100-120 rpm) folytattuk. A felnevelt tenyészeteket késői exponenciális fázisban centrifugáljuk (12 000 x g) és a sejt üledéket -20 °C-on háromszor lefagyasztjuk a sejt béltartalom feltárása érdekében A sejtüledékból klorofil-a tartalmat mértünk (A klorofill meghatározása során a 663 nm-en 80 %-os acetonban mért fényabszorpció alapján számítottuk a pigment tartalmat, E = 82.04 mg/ml (Bendall et al, 1988) és a minták relatív toxintartalmát erre vonatkoztattuk A minták toxicitásának méréséhez a mikrocisztin kimutatására és toxikológiai tesztelésére kidolgozott csíranövény-tesztet használtuk (Blue-Green Sinapis Test, Kós et al, 1995). A vizsgálati tesztnövény a fehér mustár (Sinapis alba L.). A toxicitási tesztekben, H ;O rda] sterilezett magvakat alkalmaztunk axaenikus körülmények között. A steril kémcsövekben 1 ml agarral (1 %) szilárdított tápoldat (0.5 x Hoagland) felületére, amely a friss mintát tartalmazza, 3 Eredmények és megbeszélésük A C. raciborskii BGSD 266, 280, 323 nyers sejtkivonat, a mustár csiranövény tápoldatába keverve gátolta a növények növekedését. (1-3. ábra). A sejtkivonat toxikus hatását a mustárnövény gyökér, hypocotil valamint a teljes növényhossz mérésével igazoltuk. Izolátumaink toxikusnak bizonyultak. Feltűnő volt a gyökér érzékenysége, amely a cianotoxin tartalmú agarral szilárdított táplodattal közvetlenül kapcsolatban volt. Az IC 5 0 értékek a BGSD 266, 280, 323 Cylindrospermopsis raciborskii izolátumok esetében 25-30 ng/ml klorofill-a. A brazíliai esetében a fokozott gyökér növekedésgátlás nem jelentkezett, ami a magyarországi izolátumokétól eltérő toxíntartalomra enged következtetni. 10 20 30 40 50 60 70 Hg/ml kl. » 1. ábra: BGSD 266-as törzsének kontrollra vonatkoztatott %-os növekedésgátlása a klorofil-a tartalomra vonatkoztatva A módosított mustár csíranövény-teszt toxinteszt alkalmasnak mutatkozott cianotoxin tartalmú extraktumok, valamint nagyszámú kromatográfiás frakciók tesztelésére. A teszt használatával a toyopearl HW-40-es kromatográfia során elkülönítettünk több toxikus frakciót (4. ábra).
