Hidrológiai Közlöny 1999 (79. évfolyam)

4. szám - A Magyar Hidrológiai Társaság XVII. Országos Vándorgyűlése, Miskolc, 1999. július 7–8.

vetkező: a mintánkat ülepedni hagyjuk, majd a kb. 2 cm

3 ülepített mintákhoz 0.5 cm

3 cc. etanolt adunk. Körülbelül 5 percenként még 4-5 alkalommal megismételjük. Ezután ülepedni hagyjuk legalább 1 óráig. Majd kb. ugyanannyi cc. etanolt adunk hozzá, mint amennyi az eredeti minta össztérfogata volt, majd szintén ülepedni hagyjuk és felülúszót leöntjük. Ezt a müveletet legalább háromszor megismételjük. Végül kritikus ponton szárítjuk lehetőség szerint amyl-acetátban, esetleg acetonban. (II./2.) A Lugol-oldattal történő preparálás azért szükséges, hogy a sqtszerkezetet többé-kevésbé megőrizze nekünk az esetleges későbbi vizsgálatra. Sajnos a színek változása miatt már fotózni nem nagyon érdemes az anyagot (ezért kell ezt megtenni élő állapotban). Sokszor előfordul - különösen összehasonlító vizsgálatoknál - hogy egyes tartósított mintákban levő Dinophyta fajokat évek múlva újra szeretnénk megfigyelni. Ebben a tekintetben, a szilárd cellulózvázzal nem rendelkező egyedek esetén a Lugol-oldattal történő tartósítás a legmegfelelőbb. (H./3.) A glutáraldehides preparálás azért előnyös, mert így egyrészt fénymikroszkópos és elektronmikroszkópos vizsgálatra is alkalmas a mintánk, másrészt így kihagyva több előkészítő lépést, közvetlenül már a végső preparálási eljárások következhetnek. Javasolt még - különösen a törékeny, kicsi, vagy a peridinoid életciklus elqén lévő fajok esetében - hogy 2 %-os (SEM vizsgálatokhoz), vagy 4 %-os (TEM vizsgálatokhoz) osmium-tetroxid oldatot adjunk a mintához Amennyiben a mintát mindkét vizsgálatra fel szeretnénk használni a 4 %-osat használjuk. A glutáraldehid és az osmium-tetroxid a szerkezetet megőrzi, bár itt is megemlítjük, hogy a tartósítást, preparálást már a mintavételkor, tehát minél hamarabb el kell végeznünk. A kipreparált és előkésztett (bearanyozott, beágyazott) minta az, ami biztonsággal az idők végezetéig megmarad A legszebb és legérdekesebb mintáink mehetnek veszendőbe „egy kis oda nem figyelés" miatt. A glutáraldehid- és osmium-tetroxid oldatot külön-külön készítsük el. A két oldatból készített „koktél" nem alkalmas a hatékony tartósításra. Amennyiben a minta mező- vagy oligtrófhak minősíthető vízhói származott, az első lépésben tegyünk mindkét oldatból felefele arányban annyit a mintához, mint amennyi a minta térfogata (Természetesen a megfelelő térfogatú mintavételi edény alapfeltétele mindennek) A mintánkat, ha fénymikroszkóposan már feldolgoztuk ülepítsük le, és mind az osmium-tetroxid oldatból, mind a glutáraldehid oldatból tegyünk az ülepített mintához kb. annyit, mint az ülepedett minta mennyisége, és kb. félóránként tegyünk hozzá ugyanennyit, összesen négyszer. így a tartósított mintáink hosszú ideig tárolhatók, viszonylag egyszerű az esetleges újrafelhasználásuk és a mintánk alkalmas az elektronmikroszkópos preparálásra. Euüóf vizekből származó minta esetében az a különbség, hogy mind az első lépésben - a terepen történő tartósításkor -, mind az ülepített minta esetén a mező- vagy oligotróf mintára számolt mennyiségnek kétszeresét mérjük be egy-egy alkalommal. A mintát az újrafelhasználás előtt 7,2 pH-jú foszfátpufferrel átmossuk, úgy, hogy legalább 10 percig álljon a többszöri (3-4) átmosások között a pufferben a minta. Ezután a TEM iU- SEM mikroszkópi mintaelőkészités típusától függ a további eljárás. SEM esetében desztillált vízzel legalább kétszer átmossuk, és kritikus ponton szárítjuk lehetőleg amyl-acetátban, vagy acetonban. TEM esetében a beágyazás és metszetkészítés kezdődik. (H./4.) A mintáinkat évekig tárolnunk kell. A formalinos tartósítás alkalmas ana, hogy mintánkban viszonylagos ,jó megtartással" megőrizze a szilárd, oellulózpáncéllal rendelkező egyedeket A szilárd, cellulózsejtlállal nem rendelkező egyedek ezekben a mintákban azonosíthatatlanná válnak. A formaiinban tartósított minta feldolgozása azonban viszonylag nagyobb tapasztalatot kíván, mivel az egyedek sejtfala sokszor szétesik és a sejtfal szerkezet így nehezebben azonosítható. 3. 2. Mintafeldolgozás A Dinophyta fajok határozását segítendő több vegyszert említ az irodalom: Trypan Blue, Fast Green, Von Stoch-oldat, NaOCl, Calcoflour. A NaOCl nagy hátránya, hogy csak szilárd cellulózvázas egyedek vizsgálhatók a kezelés után. A Trypan Blue, Fast Green, Calcoflour csak olyan fajok esetében alkalmazható jól (Ceratium fajok, Peridinum cinctum, Peridinium bipes), amelyeknek igen vastag a cellulózváza. A vékony vázzal rendelkező sejtek esetében szinte alig láthatóak a sejtfalat felépítő lapocskák élei, amelyek kirajzolnák a jellemző sejtfalszerkezetet. A speciális festési eljárásokat vastag sejtfalú tengeri szervezetekre dolgozták ki. Ennek köszönhetően az édesvízi Dinophyta fajokkal foglalkozó kutatók nem használják. A Von Stoch-oldatot általánosan használták a nyolcvanas évek elején, nem sokkal a kifejlesztése után egyfajta divattá vált Szinte csak úgy jelentek meg publikációk - vagy csak úgy fogadták el őket - hogy Von Stoch-oldattal festett egyedeket találunk bennük. Gyakorlatilag nem adnak több információt szilárd vázzal rendelkező fajokra nézve, mint amit egy jó mikroszkóp és körültekintő, türelmes vizsgálat eredményezhet mindenféle kezelés nélkül. A Dinophyta fajokkal foglalkozó valamennyi kutatónak van egy speciális receptje a csoport tagjainak határozására - amire esküszik - bár a lényeges lépéseket sohasem publikálják (Még személyes találkozások alkalmával sem közlik). Az általunk kifejlesztett mintafeldolgozás, határozás a következő: A taxon határozása alapvetően két részre osztható az önálló sejtfal megléte (II) vagy nem léte (I) alapján: (I) Azoknak a fajoknak a meghatározása, amelyeknek nincs önálló sejtfala az alábbi egyszerű módon történhet Ha egy rövid ideig fedőlemez alatt tartjuk őket, és elpárologtatjuk a vizet, abbahagyják az intenzív mozgást és elhagyják ostorukat. Ilyenkor kerekdeddé válik a sejt és kipukkan. Ez azt indikálja, hogy a sejt végig periplaszttal határolt. Ezek a nemzetségek: Amphidinium, Bernardium, Gymnodinium, Gyrodinium. A határozásuk szempontjából fontos az általános sejtalak, valamint a sejt-organellumok szerkezete. Ezeknek a jellemzőknek a vizsgálatakor a mintákat élő állapotban, gyűjtés után azonnal - amennyiben lehetséges - kell vizsgálni. Véleményünk szerint a csoport jelenleg érvényes elnevezése (naked) nem helytálló. Az előbb említett nemzetségekbe tartozó fajokat vélhetőleg azért nevezik „csupasz"-nak, mert nem látható egy vastag, feltűnő membrán, vagy nincs jól definiálható páncéljuk, héjuk Ennek ellenére a sejt határrétegén a membrán szerkezete bizonyos fajta feszességet, keménységet kölcsönöz az egyedeknek. Ezért a csoport elkülönítésére a páncél nélküli (umarmored) elnevezést javasoljuk Ugyanakkor a membrán ilyen jellegű tulajdonsága reményeket adhat arra, hogy univerzális pásztázó elektronmikroszkópos preparálási metodikát találjunk erre a csoportra nézve. (II). Ha a sejt nem veszti el eredeti alakját azután, hogy egy kis tartósítószert hozzáadunk (KJ+J, formaldehid, stb. ...), hanem plazmolízis játszódik le, a protoplaszt összehúzódik és eltávolodik a sejtfaltól. Fénymikroszkóppal megvizsgálván az üres sejtfalat, azt állapíthatjuk meg, hogy nincs nyilvánvaló szerkezete (II./l .) vagy, hogy egyértelmű szerkezettel rendelkezik (Ü./2.). (II/1.) Ilyenkor a sejtek a következő nemzetségekbe sorolhatók: Katodinium, sok esetben Glenodiniopsis, Hemidinium, Sphaerodinium, Woloszynska, valamint a Peridinium és Peridiniopsis fajok különböző fejlődési fázisai. Sokáig úgy gondolták, hogy a váz szempontjából alapvetően két típus létezik: váz nélküli és vázzal rendelkező. Néhány esetben a váz nélküli fajok esetében azt tapasztalták, hogy a határhártyától a protoplazma visszahúzódott. Egyes fajok esetében, ha gyenge is, de cellulózreakció volt megfigyelhető. A határréteget hosszú ideig strukturálatlannak nevezték. Igen nagy volt a meglepetés, amikor Woloszynska (1916) számos faj esetében a sejtburkon nagyon finom recézetet figyelt meg, amelyet igen jó rajzokon illusztrált. Ezt a burokrecézetet később más szerzők is megerősítették, sőt megfigyelték a burok levetését (exuviáció), mint spontán jelenséget. Ezt idézzük elő a gyakorlatban, nagyban segítve ezzel a határozást. A recézetet további vizsgálatok során ismerték meg. A sejtburok viszonylag egyenlő 5-, 6-, 7 szögű mezőkre osztott, melyek között határvonalak vannak. Ezek a határvonalak vagy nagyon vékony vonalaknak látszanak, vagy pontok sorozatának tűnnek fénymikroszkópos vizsgálattal. Maguk a burkot alkotó 5-, 6-, 7 szögű mezők sem szerkezet nélküliek. Egyes fajoknál jól kivehető központi helyzetű kinövés, vagy pórus látható, míg másoknál pontokat csak meghatározott mezőkön találtak meg. Olykor a mezők finoman areolál-