Fogorvosi szemle, 2018 (111. évfolyam, 1-4. szám)
2018-06-01 / 2. szám
41 FOGORVOSI SZEMLE ■ 111. évf. 2. sz. 2018. 7. nap elteltével vizsgáltuk a sejtek BMP-7 mRNS szintjének változását, majd az eredményeket a GAPDH háztartási génre normalizáltuk. Megfigyeléseink szerint az indukált sejtekben 24 órával az indukció után a BMP-7 mRNS szintje a nem indukált sejtekben mért szint ötszörösére, egy hét után pedig annak harmincnyolcszorosára növekszik (2. kép). Ezek alapján elmondható, hogy a sejtek doxycyclinnel történő kezelése hatékonyan indukálja a BMP-7 transzgén expresszióját, amelyhez viszonyítva a kezeletlen sejtek expressziója nem mutat számottevő változást. A BMP-7 fehérje mennyisége a sejtekben doxyciklin dózisfüggést mutat A BMP-7 fehérje expresszió szintjének vizsgálatához a sejteket, 0; 3,125; 6,25; 12,5; 25; 50; 100 és 200 ng/ml doxycyclin hozzáadásával tenyésztettük. 7 nap elteltével vizsgáltuk a sejtekben található BMP-7 fehérje mennyiségének változását. A GAPDH fehérje kimutatásával igazoltuk, hogy azonos mennyiségű fehérjét vittünk fel a gélekre. Az indukált sejtekben 7 nappal az indukció után a BMP-7 fehérje szintje különböző mértékben növekedett a hozzáadott doxycyclin mennyiségétől függően (3. kép). Ezek alapján elmondható, hogy a sejtek doxycyclinnel történő kezelése sikeresen indukálja a BMP-7 fehérje termelődését, miközben a kezeletlen sejtekben nem található detektálható mennyiségű fehérje. A növekedés a GFP termeléshez hasonlóan változik, a 12,5 ng/ml-es koncentrációig nagy léptékben növekszik, ám a koncentráció további növelése már nem okoz nagymértékű változást. Megbeszélés Tenyésztő Tenyésztő + dox ■ 1. nap B4. nap ■ 7. nap 2. kép: Doxycyclin által indukált relatív BMP-7 génexpresszió változás. A transzgén expresszié változásai kvantitatív Real-Time módszerrel mértük meg DPSC-BMP7 sejtekben doxycyclin hozzáadásával, illetve anélkül. Az eredményeket a GAPDH háztartási gén expressziójára normalizáltuk. A hibasávok a szórás értékét jelzik (n = 3). Doxycyclin (ng/ml) o $ « <o' $ ❖ mgmm — mmm mm mmm —— mmm mm mmm mmm BMP-7 GAPDH 3. kép: Dózisfüggő BMP-7 expresszió. Az in vitro BMP-7 expresszió western biot képe a különböző koncentrációjú doxycyclinnel kezelt sejtekben. A GAPDH fehérje expresszió western biot képe igazolja, hogy azonos mennyiségű összfehérje került felvitelre az akrilamid gélre. A csontszövet újraépítésére különböző differenciált sejttípusok mellett [4] alternatívát kínál az embrionális őssejtek használata, amelyek rövidebb differenciálódási útvonala [2] gyorsabb regenerációt is lehetővé tehet. A bölcsességfogak pulpájából izolált mesenchymális őssejtek kedvező tulajdonságaik miatt igen ígéretes választásnak bizonyulhatnak erre a célra. A csont irányú differenciálódás indukciójában a megfelelő növekedési faktorok jelenléte meghatározó jelentőséggel bír, a megfelelő helyre történő eljuttatásuk alapvető fontosságú a regenerációs folyamatok elindításához. Ezek a sejtek azonban stabil indukciót igényelnek, hogy elkerüljük a de-differenciációt vagy nemkívánatos sejttípussá történő transz-differenciációt és a tumorok keletkezését [14]. A problémára megoldást jelent a génterápiás technikák felhasználása, amelylyel a megfelelő faktorok génjei a sejtekbe bejuttathatok, ami által azok képessé válnak az adott transzgén expressziójára. Korábban John Yau és munkatársai [13] nem virális eredetű BMP-7 gént kódoló vektorral transzfektáltak humán fogbél eredetű sejteket, amelynek eredményeként az általuk vizsgált csont irányú differenciáció markereinek (alkalikus foszfatáz, osteocalcin) relatív szintje megnövekedett. Módszerük alkalmas lehet a sejtek ex-vivo differenciálására, ami után a sejtek terápiás felhasználása is szóba kerülhet. Az ilyen módszerrel a sejtekbe bejuttatott vektor azonban csak rövidtávon használható, idővel lebontódik, eltávolításra kerül, ezért munkánk során egy stabil géntranszferre képes lentivirális vektorrendszert használtunk a BMP-7 transzgén sejtekbe történő bejuttatására. További veszélyt jelenthet még a gének szabályozás nélküli expressziója is [12, 18, 20, 21], amelyet indukálható génexpresszió alkalmazásával kívántuk megoldani. Munkánk során sikeresen klónoztuk a BMP-7 transzgént a lentivirális vektorrendszerbe, amely rendszerben ez a transzgén igény szerint cserélhető, általa további gének szerepének vizsgálata válik lehetővé. A vektorrendszer igen nagy transzdukciós hatékonysággal bír, áramlási citometriás méréseink szerint a doxycyclinnel kezelt, transzdukált sejtek 70%-a expresszálja a GFP marker fehérjét. A doxycyclinnel indukált sejtekben már 24 óra után jelentősen emelkedik a BMP-7 mRNS szintje
