Fogorvosi szemle, 2014 (107. évfolyam, 1-4. szám)
2014-09-01 / 3. szám
100 FOGORVOSI SZEMLE ■ 107. évf. 3. sz. 2014. elfogadott modell a HSG sejtvonal, amely irradiált submandibularis nyálmirigy ductusaból származik [34], Egy másik általunk alkalmazott modell a PTHSG (vagyis Primary Total Human Submandibular Gland) primer sejtkultúra, amely a mirigy enzimes emésztését követően nyert vegyes mesenchymalis-epithelialis kultúra, ennélfogva kiválóan alkalmas a kétféle sejttípus interakcióinak modellezésére is [35]. A két említett sejtvonal Matrigelben bekövetkező differenciációját kutatócsoportunk korábban már vizsgálta [35, 36]. A submandibularis eredetű modellek vizsgálata azonban nem elegendő, hiszen a parotis a többi miriggyel szemben ectodermalis eredetű, fejlődése bizonyos pontokon eltérhet azokétól. Ezért is szeretnénk laboratóriumunkban differenciálódási modellként bevezetni a Par-C10 patkány parotis eredetű sejtvonalat, mellyel epithelialis transzportfolyamatok modellezése során már szereztünk tapasztalatokat [11], Ez a sejtvonal nagyrészt acinaris tulajdonságokat mutat: muszkarinos és adrenerg receptorokat expresszál, aktív aniontranszporttal rendelkezik, és számos transzporter aktivitása mérhető a sejteken, amelyek érintettek az acinusok elektrolit-transzportjában (Nhe1, Nbc1, Nkcc1, Ae2) [11,38]. Hasznos lehet tehát annak tisztázására, hogy mi történik az acinusokkal in vitro környezetben, hogyan történik dedifferenciálódásuk és hogyan tartható fenn differenciált állapotuk. Vizsgálati anyag és módszerek Sejttenyésztés A Par-C10 patkány parotis sejtvonal Dr. David Quissel (School of Dentistry, University of Colorado Health Sciences Center, Denver) adománya volt. A sejteket Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture Ham F-12 (DMEM/F-12) 1:1 arányú keverék tápfolyadékban (Gibco, 31330) tenyésztettük, amelyet 10% foetalis borjúszérummal (FBS) (Lonza, BW14-502F), 0,1 pM retinsavval (Sigma, R2625), 2 nM trijódtironinnal (Sigma, T6397), 0,4 pg/ml hidrokortizonnal (Sigma, H0888), és 100 lU/ml penicillinnel, 1 pg/ml streptomycinnel (Sigma, P4333) egészítettünk ki. A tápfolyadékot hetente háromszor cseréltük és 80-90% konfluencia elérésekor 1:50 arányban passzáltuk. A passzálás során a sejteket 0,25%-os tripszin-EDTA (TE) (Gibco, 25200) oldattal szedtük fel a tenyészedény aljáról. A sejtvonal tenyésztése minden esetben 37 °C-os, párásított, 5% C02-vel dúsított levegőn, tenyésztőszekrényben történt. Kísérletekhez 3-15 passzázszám közötti tenyészeteket használtunk. Kiültetés Tranwell-Clear membránra A sejteket poliészter membrán (Costar 3460, Transwell- CLEAR; pórusméret: 0,4 pm, átmérő: 12 mm, felület: 1,12 cm2) felületére ültettük, 5x105 sejtszámmal. A plasztikon használt tápfolyadékukban, steril körülmények között inkubáltuk őket. A tápfolyadékot kétnaponta cseréltük. A konfluens monolayer létrejöttét a transepithelresistentia (TER) rendszeres mérésével minden másnap ellenőriztük. A TER értékeket a Precision Instruments erre a célra kifejlesztett epithelialis volt-ohm meter (EVŐM) készülékével mértük. Kiültetés BME felületére A ParC-10 sejteket különböző koncentrációjú (6 mg/ml, 9 mg/ml, 13,2 mg/ml) csökkentett növekedési faktor tartalmú BME-vel (Basement Membrane Extract, RD-3433- 005-01) kezelt felületre ültettük ki. A különböző koncentrációjú BME-vel bevont aljzatokat BME és DMEM/F-12 tápfolyadék keverésével állítottuk elő mindvégig jégen tartva, hűtött pipettaheggyel adagolva. A Par-C10 sejteket a tenyésztőedény felületére dermedt BME rétegére ültettük ki. A 96 lyukú tenyésztőtálcán 5 párhuzamosban 105 sejtszámmal kiültetett sejteket vizsgáltuk, különböző passzázs számú fagyasztási felvételből. Kontrollként mindig nem kezelt tenyésztőedény felületére ültettük a sejteket. A morfológiai változásokat fáziskontraszt mikroszkóppal (Nikon Eclips E600) követtük, a megfigyelést 24 órán át végeztük, a sejteket a kiültetéskor és a kiültetést követően 3, 6, 18, 24 órával fényképeztük (Retiga 2000R Q Imaging Fast 1394). A fényképezések között a megszokott tenyésztési körülményeket tartottuk. Vírus vektor alkalmazása A sárga fluoreszcens proteint (EYFP-Enhanced Yellow Fluorescent Protein) kódoló adenovírust (AdEYFP) a korábban leírtaknak megfelelően készítettük [29]. Röviden, a fluoreszcens fehérjét kódoló génszakaszt CMV promoted és SV40 poliA szignált tadalmazó pACCMVpLpA plazmidba klónoztunk, amelyet HEK 293 sejtekbe kotranszfektáltunk pJM17 5-ös szerotípusú adenovirus segédplazmiddal. A HEK sejtekben a két plazmid rekombinációjával jönnek létre az AdEYFP vírusok. A Par-C10 sejtek transzdukciójához egy éjszakán át inkubáltuk a tenyészetet a vírusokat tadalmazó tápoldattal 37 °C-on. Eredmények Polarizált monolayer létrehozása A Par-C10 parotis eredetű sejtvonal jellegzetes epithel modológiát mutat, plasztik aljzaton tenyésztve szigetekben egysejtrétegként nő. A Par-C10 sejtek permeábilis poliészter membránra ültetve polarizált konfluens monolayeri alkotnak (1. ábra). A konfluens tenyészet létrejöttét a transepithel ellenállás folyamatos mérésével ellenőriztük. A transzepithel ellenállás értéke arányos nem csak a tenyészet konfluenciájával, de a sejtek közötti kapcsolatok zádságával is: hiszen a sejtek közötti szoros kapcsolatok (tight junction) kialakulása korlátozza az extracelluláris ionmozgást. A méd édékeket a membrán sejtmentes ellenállásához hasonlítottuk (135±9 item2), TER édékek a maximumot (2500-3000 Ocm2) a 6-9. nap között ér-
