Fogorvosi szemle, 2013 (106. évfolyam, 1-4. szám)
2013-09-01 / 3. szám
111 FOGORVOSI SZEMLE ■ 106. évf. 3. sz. 2013. perces, 200 pL 50%-os (v/v) acetonitril, és 50 mM NH4HC03 oldatban. 2. Tömegspektrométer (MALDI TOFÍTOF) A géldarabokat szobahőmérsékleten dehidráltuk, majd 10 pL tripszin (0.04 mg x mL-1 ) Tris puffer (2.5 mM, pH 8.5) oldattal 37 °C-on 1 éjszakán át inkubáltuk. A kivont peptideket 15 perces ultrahangos fürdőben 15 pL acetonitril és hangyasav (49/50/1 v/v/v) vizes oldatban tartottuk. Az oldatból való kivonás után a peptideket liofilizáltuk, és újra feloldottuk vízben. A liofilizált fehérje triptikus emésztményének vizes oldatát a mintatartó lemezre (MTP 384 massive target plate, Bruker Daltonics, Bremen, Germany) vittük fel. A mintatartó tálcán minden egyes 1 pL térfogatú mintaoldathoz 1 pL telített mátrix oldatot kevertünk. A mátrixoldatot minden felhasználás előtt frissen készítettük: a-ciano-4-hidroxi-fahéjsavat (CHCA) acetonitril /0.1% TFA (1/2 v/v)-ben oldva. A tömegspektrometriás méréshez Autoflex II TOF/ TOF típusú (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) készüléket használtuk. A MALDI TOF „peptid mass fingerprint (PMF)” elkészítésére a LIFT mode for PSD (post source decay) és CID (collisioninduced decay) fragmentációt alkalmaztuk automatizált üzemmódban, FlexControl 2.4 számítógépes program vezérlésével. A PMF-hez 20 kV gyorsítófeszültséget használtunk. A műszer 337 nm-en emittáló pulzáló nitrogén lézert alkalmaz a minta és a mátrix elpárologtatásához és ionizációjához (model MNL-205MC, LTB Lasertechnik Berlin GmbH., Berlin, Germany). Minden egyes mérés előtt külső tömegkalibrációt végeztünk a Bruker Peptide Calibration Standard szett segítségével (#206195 Peptide Calibration Standard, Bruker Daltonics, Bresegítségével történt. A keresés során az egyszeresen pozitív töltésű monoizotópos peptidcsúcsokat vettük figyelembe, keresési hibahatárnak 100 ppm-et, illetve 1 kihagyott triptikus hasítási helyet adtunk meg. Az adatok további feldolgozását a Bruker FlexControl 2.4 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) és a Bruker FlexAnalysis 2.4 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) programok segítségével végeztük el. Eredmények bemutatása A diabetészes és egészséges önkéntesek géljeit összehasonlítva sok különbséget találtunk. A két csoportban eltérő spotokat tömegspektrometria segítségével azonosítottuk. Több mint 900 peptidet sikerült identifikálni. A következő táblázatban csak a diabeteses betegre jellemző, laphámrákra utaló fehérjéket összegeztük. Ezek közül választottunk ki 3, korában már laphámkarcinómás betegek nyálmintájában azonosított biomarkert, melyeknek előfordulását megvizsgáltuk az egészséges csoportban is. Eredményeinket a 2. táblázat foglalja össze. A vizsgált diabéteszes betegek mintájában, 64%ban (n=16 minta) azonosítottuk mind a három biomarkert. Minden mintában sikerült azonosítsuk az annexin csoport A8-as tagját, és 84%-nál (n= 21 minta) találtunk peroxiredoxin 2-t, melyeket korábban már összefüggésbe hozták szájüregi laphámrákkal, és azonosították is rákos betegek nyálmintájában. A tirozin-protein kináz a minták 80%-ban volt azonosítható. Érdekes eredmény továbbá, hogy a típusos biomarkerek önállóan nem voltak jelen a nyálmintákban. 1. Táblázat Identifikált fehérjék Szám Név Azonosító kód Elméleti móltömeg (Da) Szekvencia fedettség% 1. Annexin A8-like 2 [Homo sapiens] gi|55666310 36,84 47,63 2. Annexin A8-like 1,- Homo sapiens (Human). Q5T2P8_HUMAN 36,86 32,72 3. Tyrosine kinase gi|473882 7,36 46,88 4. AX969656 NID: - Homo sapiens CAF14764 14,82 26,61 5. Protein kinase [Homo sapiens] gi|9886711 86,35 31,59 6. Peroxiredoxin-2 gi|2507169 21,7 64 7. Annexin A2 gi|113950 38,44 30 men, Germany). A mérések során m/z 800 és 5000 között detektáltuk a tömegspektrumokat, és minden egyes mérési eredményt 500 egymást követő lézerlövés egyesített adataiból számoltunk ki. 3. Peptidfragmentumok azonosítása A fehérjék PMF azonosítása MSDB (Swiss-Prot) és NCBInr adatbázisok alkalmazásával, majd MASCOT adatbázis (MASCOT Server 2.2 search engine, Matrix Science Ltd., London, UK) kereső motor és Bruker Bio Tools 3.0 software (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) Az identifikált fehérjék bemutatása Annexin A8 Az annexinek fontos celluláris és fiziológiás folyamatokban vesznek részt. Szerepük van a membránok scaffolding-jában, ami jelentősen összefügg a sejtek alakjával, formájával. Részt vesznek a vezikulák formálásában, továbbá megtalálhatók az endocitózis és exocitózis folyamatában is. Nem csak intracelluláris folyamatokban, de sejten kívül és megtalálhatóak. Annexinokat találhatunk a fibrinolízis, koaguláció, gyulladások és az
