Fogorvosi szemle, 2011 (104. évfolyam, 1-4. szám)
2011-03-01 / 1. szám
11 FOGORVOSI SZEMLE ■ 104. évf. 1. sz. 2011. máz. A kezelés időtartamát 5 percben határoztuk meg a H202 és a CHX gél esetében, míg 1 percben a citromsavnál. A kezelések után a próbatesteket háromszor mostuk ultratiszta vízzel, majd levegőn szárítottuk. A kontroli-csoportot ultratiszta vízzel mostuk 5 percig. Az AFM vizsgálatot a PSI A XE-100 készülékkel (Dél- Korea) végeztük. Az AFM módszer lehetőséget nyújt a felszínek érdességének mikronos-nanométeres nagyságrendű vizsgálatára, miközben a szilikon tartókarra rögzített AFM tű (típusa: P/N 910M-NSC36 (MikroMasch Eesti OU, Észtország) megközelíti és eltávolodik a vizsgált felszíntől. A vizsgálatokat kontakt módban végeztük, a magassági, deflekciós és a 3D képeket rögzítettük. 10x10 pm és 5x5 pm-es felvételeket készítettünk. Az érdesség (Ra) meghatározását az AFM software program segítségével végeztük (legalább 6 független mérés alapján). A Ti felszín kémiai összetételét XPS készülék segítségével értékeltük. A fotoelektronok AI Ka primer sugárzásból származtak (hv = 1486,6 eV), melyeket hemiszférikus elektronenergia-analizátor segítségével értékeltünk (PHOIBOS 150 MCD 9; SPECS). A röntgenágyút 150 W-on működtettük (12 kV, 12,5 mA). A kötési energiát normalizáltuk a bekötött szén C 1s csúcsához viszonyítva (285,1 eV). Az XPS spektrumban mutatkozó változásokat 30-60 perc He+ bombázást követően detektáltuk. A Fle+ ionokat ionágyúval (5 kV) generáltuk, és a beeső ionsugarat 200 nA-nél mértük. A bombázás kb. 10 nm felszíni anyagot távolított el. Széles illetve nagy felbontású, keskeny spektrumokat vettünk fel, és a Ti 2p, O 1s és C 1s karakterisztikus vonalakat vizsgáltuk. Sejtkultúra - vizsgálatok Egészséges páciensekből - egyébként is szükséges szájsebészeti beavatkozás során - eltávolított gyulladásmentes nyálkahártyából izoláltunk orális epithel sejteket. A donorok életkora 18 és 46 év között volt. A vizsgálati protokollt a Szegedi Tudományegyetem Flumán Orvosbiológiai Etikai Bizottsága jóváhagyta, a kutatásetikai mérték mindenben megfelelt a Helsinki Egyezménynek. A nyálkahártya-darabokat először 2% antibiotikumantimikotikum oldattal (Sigma-Aldrich GmbH, Németország) kiegészített Salsol A oldatban mostuk (Human Rt., Gödöllő, Magyarország). Ezután a mintákat dispase enzimoldatban (Grade II, Roche Diagnostics, Mannheim, Németország) inkubáltuk egy éjszakán át, 4 °C-on. Másnap elválasztottuk egymástól a dermiszt és az epidermiszt [16]. Az izolált epidermiszt 0,25%os trypszin-EDTA oldatban inkubáltuk (Sigma-Aldrich GmbH, Németország) 5 percig, 37 °C-on, így a szövetből sejteket nyertünk. A sejtszuszpenziót 200 g-n 10 percig 4 °C-on centrifugáltuk, majd a továbbiakban az epidermális sejteket 25 cm2-es flaskákban tenyésztettük (Orange Scientific, Belgium). Az orális epithel sejteket keratinocita szérummentes médiumban (Gibco BRL, Eggstein, Németország) tenyésztettük. A tápfolyadékot 5 pg/ml rekombináns epidermális növekedési faktorral (Gibco BRL, Eggstein, Németország), 50 mg/ml borjú agyalapi mirigy-kivonattal (Gibco), 1% L-glutaminnal és 1% antibiotikum/antimikotikum oldattal egészítettük ki (1% penicillin G, 1% streptomycin szulfát és 0,0025% amphotericin B; Sigma-Aldrich GmbH, Németország). A tápfolyadékot hetente háromszor cseréltük le a sejttenyészeteken. A primer epithel sejtkultúra 8-16 nap alatt vált konfluenssé. A konfluens primer kultúrákat PBS-el mostuk (phosphate-buffered saline, pH = 7,4, Gibco) és 2-4-percig kezeltük 0,25%-os trypsin-EDTA oldattal (Sigma-Aldrich GmbH, Németország). A sejteket 2-4 egyenlő részbe passzáltuk. A kultúrákat 37 °C- on, párás környezetben, 5%-os C02 tartalom mellett tenyésztettük. 1. ábra Humán epithél sejtkultúra fénymikroszkópos felvételei. Az (A) felvételen néhány letapadt epithél sejt látható, míg a (B) felvételen konfluens tenyészet. 200x-os nagyítás. Inverz optikai mikroszkóppal (Nikon TS 100, Japán) felvételeket készítettünk a tenyésztőoldatban lévő letapadt sejtekről 200x nagyításban. A primer (1a. ábra) és konfluens (1b. ábra) tenyészetben láthatóak az
