Fogorvosi szemle, 2009 (102. évfolyam, 1-6. szám)

2009-10-01 / 5. szám

176

FOGORVOSI SZEMLE ■ 102. évf. 5. sz. 2009.

les körű differenciációs képességekkel rendelkeznek, az utóbbiak felhasználásával kapcsolatos etikai problémák a posztnatális sejtek alkalmazásával áthidalhatóak. A posztnatális őssejtek kutatása és alkalmazása tekintetében a csontvelő a legrészletesebben vizsgált szövet. A csontvelőben két különböző, de egymástól kölcsönösen függő sejtpopuláció, a haemopoetikus és a csontvelőstroma-őssejtek találhatók. Számos tanulmány mutatta be a két sejtpopuláció közötti kooperatív kölcsönhatásokat. A hemopoietikus sejtek hatással vannak a stromális sejtek aktivitására, és a csontvelő stromája szignalizációs faktorokkal vesz részt a vérsejtek érési folyamatában [13]. A csontvelői haemopoetikus őssejtek transzplantációjának irodalma igen kiterjedt, ugyanakkor sokkal kevesebb közlemény foglalkozik csontvelő-stroma sejtjeinek transzplantációjával. Amikor in vitro tenyésztjük a csontvelői sejteket, a nemhaemopoetikus eredetű letapadó sejtek elszaporodnak, és ezeken a sejteken csontvelő stromára jellemző markerek mutathatók ki [14,15,16]. A csontvelőből izolált és kultúrában tartott stromális sejteket csontvelői stromális sejteknek (bone marrow stromal cell = BMSC) nevezik. Az in vitro felszaporított BMSC-k gazdag forrásai lehetnek az osteogén progenitor sejteknek, amelyek alkalmasak a csontsérülések regenerációjának elősegítésére [17,18,19].

A posztnatális őssejtek kapcsán tett felfedezések felvetették a lehetőséget, hogy a fogeredetű szövetek ugyancsak tartalmaznak hasonló sejteket. A csontvelői őssejtek izolálásakor alkalmazott módszerek felhasználásával végzett vizsgálatokból mára már világossá vált, hogy ezekben a szövetekben is találhatóak magas proliferációs aktivitással rendelkező, klonogén sejtek [20,21,22,23]. A fogak fő állományát képező dentin a csontoktól eltérően nem épül át, bár károsodást követően a dentinállomány limitált újraképződése megfigyelhető. Ehhez hasonlóan, a fogakat az alveoláris csonthoz rögzítő gyökérhártya részleges regenerációja is megfigyelhető. Korábban is feltételezték, hogy ennek lehetőségét a szövetekben elhelyezkedő prekurzor sejtek teremtik meg. Az elmúlt néhány év során az emberi maradó és tejfogak pulpájából [20,22,24] is multipotens őssejteket izoláltak. Leggyakrabban alkalmazott elnevezésük DPSC (= dental pulp stem cell). Ezek a sejtek kultúrában hosszan fenntarthatóak, osztódnak, átültethetők. Megfelelő körülmények között differenciálódásra, sőt mineralizációra is képesek [20,22, 23,25]. Előzetes eredmények szerint a fogeredetű multipotens őssejtek, s ezek közül is leginkább a tejfogak pulpájából izolált sejtek képesek más szövettípusokká is differenciálódni, így adipogén indukciót követően zsírsejtekké alakulni, vagy neurogén aktiválást követően idegi differenciálódás jellegzetességeit mutatni [22]. Ugyanakkor sem a fogszövet sejtes elemei irányába, sem az egyéb szövetek irányába történő differenciálódás celluláris mechanizmusa, s ennek molekuláris szabályozása nem tisztázott.

Vizsgálataink célja primer sejttenyészetek létrehozása volt humán fogpulpából. Emellett ezekben a kultúrákban klonogén, progenitor tulajdonságokú sejteket kívántuk azonosítani, valamint a sejtkultúrák proliferációs képességét jellemezni.

Vizsgálati anyag és módszerek

Szövetminták

Vizsgálatainkhoz sebészileg eltávolított impaktált bölcsességfogakat használtunk fel, melyeket a Semmelweis Egyetem Klinikáin kezelt betegekből nyertünk. A mintagyűjtés a Semmelweis Egyetem etikai bizottsága által jóváhagyott protokoll szerint történt, a betegek írásos beleegyezésével.

Sejtizolálás és sejttenyésztés

Az irodalomban fellehető metodikák adaptálásával és továbbfejlesztésével végeztük a sejtek izolálásának és tenyésztésének módszertanát [20,26,27], A fogeltávolítást követően a fogat azonnal steril fiziológiás sóoldatba helyeztük. A pulpakamrát steril fúróval tártuk fel, és a pulpát steril körülmények közt izoláltuk, és azonnal szobahőmérsékletű penicillin-streptomycinnel kiegészített fiziológiás sóoldatot tartalmazó 2 ml-es Eppendorf-csövekbe helyeztük. A laboratóriumba történő átszállítás után a mintákat 5 percen keresztül 800/perc fordulaton 37 °C-on centrifugáltuk. A felülúszó eltávolítását követően a pulpaszövetet mintánként 2 ml térfogatú, 3 mg/ml kollagenáz I (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri) és 4 mg/ml diszpáz (Roche, Basel, Switzerland), keverékében emésztettük 1 órán keresztül 37 °C- on. Az emésztés ideje alatt 20 percenként vortexeltük a mintákat. Az enzimatikus emésztést követően a mintákat a fent említett eljárással centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk. A szövetmintákat tenyésztőmédiumban felvéve 22G átmérőjű injekciós tűk segítségével mechanikusan fellazítottuk, majd hatüregű műanyag tenyésztőedények egy-egy üregébe ültettük ki 70 pm átmérőjű szitaszöveten átszűrve.

Az így nyert sejteket 37 °C-on inkubáltuk steril körülmények között, 100% páratartalom mellett, 5% C02-dal dúsított levegőn, tenyésztőszekrényben tenyésztettük. Eagle’s Medium Alfa (a-MEM) (Invitrogen, Carlsbad, California) modifikációját használtuk tápfolyadékként, 100 pM/ml L-aszkorbinsav 2-foszfáttal, 2 mM/ml glutaminnal, 100 U/ml penicillinnel, 100pg/ml streptomycinnel és 20% fötális borjúszérummal (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, California) kiegészítve. Műanyag tenyésztőedényben, illetve tenyészpalackban tartottuk a sejtkultúrákat. Hetente kétszer végeztünk tápcserét, a tenyészeteket szükség szerint passzáltuk. A sejtek szubkultiválása 0,25% tripszint és 0,2% EDTA-t tartalmazó oldattal történt (37° C, 10’), végül a sejteket tápközegben vettük fel. A kolóniaformáló képességvizsgálatához a 10-14 napos a kultúrákat 4%-os formaiinnal fixáltuk, majd Giemsa oldattal festettük. Az 50 sejtnél nagyobb sejtcsoportokat tekintettük kolóniának.