Fogorvosi szemle, 2008 (101. évfolyam, 1-6. szám)
2008-08-01 / 4. szám
156 FOGORVOSI SZEMLE ■ 101. évf. 4. sz. 2008. A posztnatális őssejtek kapcsán tett felfedezések felvetették annak lehetőségét, hogy a fogeredetű szövetek ugyancsak tartalmaznak hasonló sejteket. A csontvelői őssejtek izolálásakor alkalmazott módszerek felhasználásával végzett vizsgálatokból mára már világossá vált, hogy ezekben a szövetekben is találhatóak magas proliferációs aktivitással rendelkező klonogén sejtek [4, 5]. A fogak fő állományát képező dentin a csontoktól eltérően nem épül át, bár károsodást követően a dentinállomány limitált újraképződése megfigyelhető. Ehhez hasonlóan, a fogakat az alveoláris csonthoz rögzítő gyökérhártya részleges regenerációja is bekövetkezhet. Korábban is feltételezték, hogy ennek lehetőségét a szövetekben elhelyezkedő prekurzor sejtek teremtik meg. A közelmúltban sikerült kimutatni őssejtek jelenlétét tej- és maradó fogak pulpaszövetében egyaránt. A tejfogak pulpájából jelentős mennyiségű őssejtet (SHED) [6] sikerült izolálni, melyek szignifikánsan magasabb proliferációs aktivitást mutattak, mint a maradó fogakból izolált őssejtek (DPSC) [7], illetve a csontvelőből izolált őssejtek (BMSC) [8]. Emellett ezek a sejtek (SHED) meglepő módon képesek voltak in vivo más szövetek létrehozására, többek között idegszövet képzésére, valamint új csontképzés beindítására. Ezzel szemben a maradó fogakból származó őssejtek (DPSC) in vivo képesek voltak kezdetleges dentin-pulpa komplex létrehozására, azonban nem differenciálódtak más szövetféleségekké [9, 10]. A legújabb kutatási eredmények szerint gyökérhártyarost eredetű őssejtek (PDLSC) izolálására is sor került. A kezdeti eredmények arra utalnak, hogy ezek a sejtek in vivo képesek voltak parodontális rostrendszer de novo képzésére, illetve regenerációjára [11, 12], valamint in vitro neuronális differenciációra is [13]. A gyökérhártya eredetű progenitor sejtek fontos szerepet töltenek be a parodontális regenerációban, ezt segíti elő a regeneratív fogágyműtétek során alkalmazott zománcmátrix derivátum tartalmú Emdogain [14]. A fogfejlődés során a Hertwig-féle hámhüvely sejtjei által szekretált fehérjemolekulák fontos szerepet töltenek be a cementogenezis során. Ezeket a proteineket összefoglaló néven zománcmátrix proteineknek (EMP) nevezzük. E fehérjecsalád közel 90%-át amelogenin alkotja. Az amelogenin kémiai szerkezete a filogenezis során csupán kis mértékben alakult át, és a különböző fajokban alig mutat eltérést [15]. AZ EMP-t fiatal sertések fejlődő fogcsíráit körülvevő fogzacskóból vonják ki. Mivel az EMP hidrofób, ezért vivőanyagként propilén glikol alginátot (PGA) használnak, hogy a klinikai felhasználásra alkalmassá tegyék. Ezt nevezzük zománcmátrix derivátumnak (EMD). Vizsgálati anyag és módszerek Szövetminták A vizsgálatainkhoz sebészileg eltávolított impaktált bölcsességfogakat használtunk fel, melyeket a Semmelweis Egyetem Parodontológiai Klinikáján kezelt betegekből nyertünk. A vizsgálatainkhoz érvényes etikai engedélyekkel rendelkezünk, és a mintagyűjtéshez minden esetben írásos beleegyezést kaptunk. Sejtizolálás A sejtek izolálásának és tenyésztésének módszertanát az irodalomban fellehető metodikák adaptálásával és továbbfejlesztésével végeztük [11]. A vizsgálni kívánt őssejtek kinyerése érdekében a fogeltávolítást követően a fogat azonnal steril fiziológiás sóoldatba helyeztük, annak külső felszínét kizárólag steril eszközökkel érintve. Az ezt követő lépéseket szintén steril körülmények között végeztük (steril kesztyűben, steril fogó-, fúró- és vágóeszközökkel). Fogorvosi szék mellett a fog felszínéről szikepenge segítségével távolítottuk el az életképes gyökérhártyarostokat. A szövetmintákat az izolálást követően azonnal szobahőmérsékletű penicillin-streptomycinnel kiegészített fiziológiás sóoldatot tartalmazó 2 ml-es Eppendorf-csövekbe helyeztük. A laboratóriumba történő átszállítás után a mintákat 5 percen keresztül 800/perc fordulaton 37 °C-on centrifugáltuk. A felülúszó eltávolítását követően a gyökérhártyaszövetet mintánként 2 ml térfogatú, 3 mg/ml kollagenáz I (Sigma-Aldrich, St.Louis, Missouri) és 4 mg/ml diszpáz (Roche, Basel, Swittzerland) keverékében emésztettük 1 órán keresztül 37 °C-on. Az emésztés ideje alatt 20 percenként vortexeltük a mintákat. Az enzimatikus emésztést követően a mintákat a fent említett eljárással centrifugáltuk, a felülúszót eltávolítottuk. A szövetmintákat tenyésztőmédiumban felvéve 22G átmérőjű injekciós tűk segítségével azokat mechanikusan fellazítottuk, majd 70 pm átmérőjű szitaszöveten átszűrve hatüregű műanyag tenyésztőedények egy-egy üregébe ültettük ki. Sejttenyésztés A sejteket 37 °C-on inkubáltuk steril körülmények között, 100% páratartalom mellett, 5% C02-dal dúsított levegőn, tenyésztőszekrényben. Tápfolyadékként az Eagle’s Medium Alfa (a-MEM) (Invitrogen, Carlsbad, California) modifikációját használjuk, 100 pM/ ml L-aszkorbinsav 2-foszfáttal, 2 mM/ml glutaminnal, 100 U/ml penicillinnel, 100pg/ml streptomycinnel és 15% totális borjúszérummal (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, California) kiegészítve. A kultúrákat műanyag tenyésztőedényben, illetve tenyészpalackban tartottuk. Tápcserét hetente kétszer végeztünk, a tenyészeteket szükség szerint - általában hetente egy alkalommal - passzáltuk 1:4 arányban. A sejtek szubkultiválása 0,25% tripszint és 0,2% EDTA-t tartalmazó oldattal történt (37 °C, 10’), végül a sejteket tápközegben vettük fel. A kolóniaformáló képesség vizsgálatához a 10-14 napos a kultúrákat 4%-os formalinnal fixáltuk, majd Giemsa oldattal festettük. Kolóniának az 50 sejtnél nagyobb sejtcsoportokat tekintettük.
