179770. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dns-polimeráz enzim szilárd hordozóhoz való kötésére és ennek alkalmazása polideazoxinukleotidok szintézisére
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG SZABADALMI LEÍRÁS 179770 L SZOLGALATI TALÁLMÁNY lp| Bejelentés napja: 1979. XI. 21. (MA—3242) Nemzetközi osztályozás: w Közzététel napja: 1983. III. 29. C 07 H 21/04 C 12 N 11/10 NSZOj ÜT ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL Megjelent: 1984. III. 31. /o^°s \I Vadaim; Tér Feltalálók : Szabadalmas: Dr. Sági János oki. vegyész 38% MTA Központi Kémiai Kutató Dr. Ötvös László oki. vegyész 38% Intézete, Budapest Fritzsche Károlyné vegyésztechnikus 10% Dr. Szabolcs Öttóné oki. vegyész 6% Dr. Szemző Attila oki. vegyész 3% Kruppa Gábor vegyészmérnök 3% Pál Iván vegyésztechnikus Budapest 2% Eljárás DNS-polimeráz enzim szilárd hordozóhoz való kötésére és ennek alkalmazása polidezoxinukleotidok szintézisére 1 A találmány tárgya eljárás polidezoxinukleotidok szintézisére 2'-dezoxinukIeozid-5'-trifoszfátokból aktív centrumához nem tartozó szabad merkaptocsoporttal rendelkező DNS-polimeráz enzimmel kétértékű kation és adott esetben minta-Iáncindító komplex jelenlétében, az alkalmazott enzimnek megfelelő 6,5 és 9,5 közötti pH-jú pufferolt vizes közegben, 15 °C és 42,0 13C közötti hőmérsékleten. A minta-Iáncindító komplex az előállítani kívánt polidezoxinukleotiddal azonos minta molekula. Ismeretes, hogy polidezoxinukleotidok enzimatikus szintézisét homogénfázisú eljárásokban végzik. Ilyen módszert ismertet például J. F. Burd és R. D. Wells, J. Mól. Bioi. 53, 435—459 (1970); F. J. Bollum, Procedures in Nunleic Acids Research, 591. oldal, Ed. by Cantoni, G. L. és Davies, D. R., New York, Harper és Row (1966); J. Sági, A. Szabolcs, A. Szemző és L. Ötvös, Nucleic Acids Res. 4, 2767—2777 (1977). Ezeknél az eljárásoknál a pufferolt reakcióelegy tartalmazza a szubsztrátot, a minta-Iáncindító komplexet, az enzimet és az enzim optimális működését biztosító kationokat. A reakcióeiegyet inkubálják, a reakció befejezése után az enzimet denaturálják (például a reakcióelegy felmelegítésével), majd a kicsapott enzimfehérjét eltávolítják az elegyből. A nyert polidezoxinukleotid elegyből a nagy molekulasúlyú polimereket dialízissel végzett tisztítással nyerik ki. Az így előállított polidezoxinukleotidokat DNS- modellként használják a nukleinsavak fizikai, kémiai, biokémiai és biológiai tanulmányozására. 2 Általánosan használt DNS-modell például a 2'-dezoxiadenozin-5 '-monofoszfát (dAMP) és a timidin-5'-monofoszfát (dTMP) szigorúan váltakozó szekvenciájú dupla hélixű kopolimerje: 5 ... -dAMP-dTMP-d AMP-dTMP... melynek rövidítése: poli d(A—T). DNS-függő DNS-polimerázok esetén az új DNS-szál nukleotid sorrendjét a reakcióelegybe vitt minta DNS nukleotid sorrendje határozza meg. Poli d(A—T) szin- 10 téziséhez ezért ugyanilyen poli d(A—T) minta-Iáncindító komplex szükséges. Megfelelő láncindító komplex bevitelével különböző polidezoxinukleotidok állíthatók elő, így például poli(dA). poIi(dT), poli d(G—C), poli d (I—C), poli (dG).poli (dC), poli (dl).poli (dC) stb., 15 ahol A=adenin, T=timin, G=guanin, I=inozin, C= =citozin. Egyes DNS-polimeráz enzimek azonban ilyen kívülről bevitt láncindító komplex nélkül is képesek a poli d(A—T) úgynevezett de novo szintézisére. Ilyen enzim 20 például az E. coli DNS-polimeráz I enzim. A polinukleotidok enzimatikus szintézisére szolgáló ismert eljárások hátránya, hogy az enzim csak egyszer használható fel, és a reakcióelegy feldolgozásakor az enzim eltávolítása annak denaturálásával jár együtt. 25 Célul tűztük ki olyan eljárás kidolgozását, amellyel ezek a hátrányok kiküszöbölhetők. A találmány alapja az a felismerés, hogy a fenti cél elérhető, ha a polidezoxinukleotidok szintézisét szilárd 30 hordozóhoz rögzített enzim segítségével végezzük. így az 179770
