175585. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklodextrin-glükozil-transzferáz enzim előállítására
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG SZABADALMI LEÍRÁS SZOLGALATI TALALMANY 175585 JP||| Nemzetközi osztályozás: C 12 D 13/10 Bejelentés napja: 1977. V. 26. (Cl—1857) C 08 B 37/16 Közzététel napja: 1980. III. 28. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI Megjelent: 1981. III. 31. HIVATAL Feltalálók : Szabadalmas : Vakaliu Hariklia mikrobiológus, Budapest, 25% CHINOIN Gyógyszer és Vegyészeti Seres Gábor vegyészmérnök, Budapest, 25% Termékek Gyára Rt., Budapest Miskolci-Török Mária biológus, Budapest, 25% dr. Szejtli József vegyészmérnök, Budapest, 15% dr. Járai Miklós mikrobiológus, Budapest, 10% Eljárás ciklodextin-glükozil-transzferáz enzim előállítására 1 A találmány tárgya eljárás a Bacillus macerans te nyésztésével kapott fermentléből egy lépésben, szennyező mzúnektől mentes ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzim, amelynek felhasználásával jelentősen megnövelhető a keményítőnek ciklodextrinekké történő konverziója, kinyerésére, affinkromatográfiás módszerrel. A ciklodextrinek 6—10 glükózegységből a-l,4-es glükozidos kötéssel felépült ciklikus oligomerek. A 6 glükózegységből álló oligomert a-ciklodextrinnek vagy ciklohexaamilóznak is nevezik, a 7, 8 és több glükózegységből állókat pedig sorban ß-, y- és így tovább, -ciklodextrineknek, illetve ciklohepta-, ciklookta-amilózoknak nevezik. A ciklodextrinek keményítőből képződnek, illetve állíthatók elő a dklodextrin-glíikoziltranszferáz (szisztematikus nevén a-l,4-glükán-4-glükoziltranszferáz, ciklizáló enzim, E. C. 2. 4.1. 19) enzim glükozidkötést hasító és egyben gyűrűzárást katalizáló hatása révén. Az enzim kinyerése a különböző Bacillus macerans törzsek tenyészetéből történik. A fermentlében mindenkor képződnek keményítőt hidrolizáló enzimek (amilázok) is. amelyek csökkentik a ciklodextrin termelését. Ezek elválasztása tehát lényeges gazdasági és technológiai szempontból egyaránt. Fél üzemi méretű ciklodextrin termelésié eddig csak centrifugált fermentlevet használtak [Die Stärke. 15, 280 (1963)]. Laboratóriumi méretekben ismertek olyan eljárások, amelyekkel részben tiszta, vagy egyéb esetekben kémiailag homogén enzim nyerhető. Erre a célra acetones szelektív kicaapást használtak [L AppL Chem. 2 Biotechn., 21, 330. (1975), illetve Die Stärke, 27, 410. (1975)], de a hidrolitikus enzimek eltávolítására többlépéses, bonyolultabb eljárások szükségesek. így többszöri alkoholos frakcionálás, szemcsés keményítőn vég- 5 zett adszorpció és elúció, illetve ammónium-szulfátos frakcionált kicsapás [Cereal Chem., 29, 108. (1952)], vagy ammónium-szulfátos frakcionált kicsapás, szemcsés keményítőn végzett adszorpció, DEAE-cellulózon, illetve Sephadex G—75-ön végzett kromatografálás 10 [Agr. Bioi. Chem., 38, 387. (1974)] alkalmazásával nyerhető hidrolitikus komponensektől mentes enzim. A kapott hozamok 20 illetve 50%-osak voltak. Az általunk kidolgozott, a találmány tárgyát képező egylépéses eljárás alkalmas arra, hogy az előzőkben kö- 15 zölt soklépéses, bonyolult, sok veszteséget okozó módszerek helyett alkalmazva, azokkal azonos tisztaságú, hidrolitikus enzimektől mentes preparátumot állítsunk elő. A találmány szerinti eljárás alapja rögzített ciklo- 20 dextrinek félhasználása. Méréseink szerint a rögzített ciklodextrinek a fermentléből csak a ciklodextrin-glükoziltranszferáz enzimet kötik meg. A szennyező enzimek és egyéb anyagok kötődés nélkül visszamaradnak. A ciklodextrinek rögzítését agarózvázhoz ismert mó- 25 don végeztük [J. Chromatogr., 90.87. (1974)]. A kapcsolás lényege egy dioxirán vegyület, az 1,4-bisz(2,3-epoxipropoxi)-bután felhasználása, amelynek egyik epoxicsoportja az agaráz valamelyik hidroxikaoportjához, a másik pedig a ciklodextrin valamelyik bidroxiksoport- 30 jához kapcsolódik. 175585
