167097. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens trigliceridek meghatározására
MAGTAB NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1973. IV. 11. (BO-1423) Német Szövetségi Köztársaság-beli elsőbbsége: 1972. VI. 19. (P 22 29 849.3) Közzététel napja: 1975. III. 28. Megjelent: 1976. VI. 30. 167097 Nemzetközi osztályozás: G 01 n 31/14 Feltalálók: Dr. Wahlefeld August Wilhelm vegyész, Weilheim/Obb, Möllering Hans vegyésztechnikus, Tutzing/Obb, dr. Gruber Wolfgang vegyész, Garatshausen, Bernt Erich gyógyszerész, München, dr. Roeschlau Peter vegyész, Tutzing/Obb, Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Boehrínger Mannheim GmbH, Mannheim-Waldhof, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás és reagens trigliceridek meghatározására 1 A találmány tárgya eljárás és reagens trigliceridek meghatározására a gliceridek elszappanosítása és a felszabaduló glicerin meghatározása útján. A gliceridek meghatározása mind az élelmiszer-analitikában, mind az orvosi diagnosztikában -különösen a hiperlipémia diagnózisánál a klinikai kémiában - egyre fontosabb szerepet játszik. Ismert eljárás szerint a meghatározás úgy megy végbe, hogy először alkoholos lúggal a triglicerideket elszappanosítják, majd a képződött glicerint meghatározzák. A meghatározás célszerűen enzimatikus eljárások után történik. Ezeknél a glicerint adenozintrifoszfát (ATP) glicerinkináz jelenlétében glicerin-1-foszfáttá foszforilálják, adenozindifoszfát (ADP) képződése mellett. A képződött ADP foszfoenolpiruvát (PEP) hatására piruvátkináz jelenlétében újra ATP-vé alakul át, piruvát képződése mellett. A képződött piruvátot a redukált formájú nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) laktátdehidrogenáz (LDH) jelenlétében laktatta redukálja, miközben a NADH nikotinamid-adenin-dinukleotiddá (NAD) oxidálódik. A reakcióban felhasznált NADH mennyisége egyenértékű a glicerin mennyiségével. A NADH mennyiségileg könnyen meghatározható 366, 340 vagy 334 nm-en mért abszorpciója alapján. Ezen ismert eljárás alapvető hátrányát az etanolos alkálilúggal való elszappanosítás jelenti. Ez az elszappanosítási lépés az egyébként specifikus, pontos és könnyen kivitelezhető módszert körülményessé és időrablóvá teszi, mivel egyedül az elszappanosítás 20-30 percet igényel, 70 C° hőmérsékleten. Az elszappanosítási követően semlegesíteni és centrifugálni kell, még mielőtt 5 maga a glicerin-meghatározás elkezdhető lenne. Ez a hátrány kiküszöbölhető egy a bejelentő előtt ismert eljárás szerint a trigliceridek enzimatikus elszappanosítása által, melynél Rhizopus 10 arrhizusból szármázó lipáz használatos. Ennél a módszernél meglepő volt, hogy olyan lipázt lehetett találni, mely vizes pufferben a triglicerideket elfogadható idő alatt tökéletesen zsírsavakra és glicerinre képes hasítani. Más lipázok, 15 különösen a közismert pankreász-lipáz, alkalmatlannak bizonyultak. Mégis, az enzimatikus hasítás hátránya, hogy az elszappanosítás még mindig meglehetősen so-20 káig tart, azonfelül az igen drága enzimből jelentős mennyiség szükséges. Alkalmas reakcióidő eléréséhez próbánként körülbelül' 1 mg enzimre van szükség. Ezenfelül a reakcióidő több mint 30 perc és ezért rutinjellegű laboratóriumi vizsgála-25 tokhoz, különösen gyakori vizsgálatok esetén, csak kevéssé alkalmas. Végül a felszabadult zsírsavak kalcium- és magnéziumionokkal oldhatatlan szappanokat képeznek, melyek zavarosodáshoz és ezáltal a mérési eredmények meghamisításához ve-30 zetnek, ha nem centrifugálják le őket.
