166364. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kreatinin-amidohidroláz és adott esetben kreatin-amidinohidroláz kinyerésére

MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG SZABADALMI LIÍRAS 166364 jMÉIS^k lip Bejelentés napja: 1972. V. 04. (BO—1369) Nemzetközi osztályozás: C 07 g 7/028 C 12 d 13/10 nwr Német Szövetségi Köztársaság-beli elsőbbsége: 1971. V. 05. (P 21 22 298.0) ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL Közzétéve: 1974. VIII. 28. Megjelent: 1976. IV. 30. Feltalálók: Möllering Hans végy. technikus, Dr. Beaucamp Klaus vegyész, Dr. Nelboeck-Hochstetter Michael vegyész, Prof. Dr. Bergmeyer Hans Ulrich vegyész, Tutzing/Obb., Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim-Waldhof, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás kreatinin-amidohidroláz és adott esetben kreatin-amidinohidroláz kinyerésére i A találmány tárgya eljárás kreatinin-amidohidroláz és adott esetben kreatin-amidinohidroláz enzimek kinyerésére kreatinin-amidohidrolázt tartalmazó mikroorganizmusokból, célszerűen például Alcaligenes specieshez tartozó törzsekből. 5 A klinikai kémiában, különösen a vese-működés diagnosztikáját illetően fontos szerepet játszik a fehérje anyagcsere közbenső és végtermékeinek meghatározása. Ezekhez tartozik a kreatinin és a kreatin is. A kreatin meghatározását eddig már többször leírták. Az ismert 10 módszerek többsége nem-enzimatikus Jaffé-reakción alapul, amelynek az a hátránya, hogy nem specifikus. [(Zeitschrift Physiol. Chemie 10, 391 (1886), Dubos, Miller: J. Biol. Chem. 121, 429, (1937)]. Továbbá leírtak már egy specifikus mikrobiológiai 15 meghatározási módszert izolált baktériumokkal, amelyben mosott sejt-szuszpenziókat alkalmaznak a kreatinin mérésére és a karbamid és az ammónia képződést használják fel az enzimhatás mértékéül. Oldható, a kreatininin lebontásra alkalmas enzimextraktot azonban nem 20 sikerült ily módon kapni. Az enzimek segítségével történő specifikus kreatinin-meghatározás megalkotásának feltétele az volt, hogy olyan alkalmas, oldható enzimeket találjanak, amelyek specifikusak és a kreatinin mérhető átalakulását katalizálni képesek. 25 Roche, Lacombe és Girard (BBA 6, 210, 1950.) két Pseudomonas-típusú kreatinázban a kreatinázt és egy glükociaminázt olyan specifikus enzimként jellemeztek, amelynek szubsztrátumaikból a guanidino-csoportból karbamidot szabadítanak fel. Továbbá Akamatsu és 30 munkatársai (Enzymologia, 15, 122, 158, 173. old., 1951.) leírtak a talajbaktériumok között egy kreatinmutázként megjelölt enzimet, amely a kreatinin és kreatin közötti egyensúly beállítására van hatással. Alább közöljük a kreatinin feltételezett lebontási folyamatát : Kreatinin=kreatin -» karbamid és szarkozin ->• glicin -• ammónia. Most sikerült a kreatinin-lebontás fent feltételezett útját bebizonyítani és először a mikroorganizmusokban két olyan enzimet kimutatni és nagy tisztaságban izolálni, amelyek a fenti lebontási folyamatban döntően részt vesznek. A találmány tárgya ezen enzimek izolálása és tisztítása. A találmány szerinti eljárás lényege kreatinin-amidohidroláz és adott esetben kreatin-amidinohidroláz mikroorganizmusokból történő kinyerése oly módon, hogy egy kreatinin-amidinohidrolázt tartalmazó mikroorganizmust feltárásnak vetünk alá, a vízoldható feltárási frakcióból önmagában ismert módon, 7,0-nál magasabb pH-értéken biokémiai tisztítási, illetve frakcionális módszerrel — egyidejűleg egy olyan próbát alkalmazva, amelynek segítségével a bevitt kreatininból képződött kreatint önmagában ismert módon meghatározzuk — a kreatinin-amidohidrolázt megtisztítjuk és végül adott esetben a jelenlevő kreatin-amidinohidroláz mellől ioncserélő-kromatográfiás módszerrel elválasztjuk. A találmány szerinti eljárással kapott két enzim a következő reakciófolyamatot katalizálja: 166364 1