165727. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peroxidáz enzim előállítására
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS SZOLGÁLATI TALÁLMÁNY Bejelentés napja: 1972. IX. 27. Közzététel napja: 1974. V. 28. Megjelent: 1976. VI. 30. (RE-517) 165727 Nemzetközi osztályozás: C 07 g 7/022 Feltalálók: JÉCSAI GYÖRGY biokémikus, 30%, RISS László vegyészmérnök, 20%, KALMÁR Dezső vegyészmérnök, 20%, Dr. PALÁGYI Tivadar vegyészmérnök, GYIMESI Lászlóné technikus, 10%, BOROS Gyula technikus, 10% Budapest Tulajdonos: Reanal Finomvegyszergyár, Budapest 10%, Eljárás peroxidáz enzim előállítására A találmány tárgya eljárás peroxidáz enzim előállítására. Ismeretes, hogy a peroxidáz növényi eredetű, globuláris fehérje, amelyet leggyakrabban az étkezésre is használatos közönséges torma gyökeréből különítenek el. Molekulasúlya kb. 400 000; vízoldékony, hőre és szerves oldószerekkel szemben kevéssé érzékeny anyag. A liofilezést jól bírja; tiszta állapotban kristályosítható. A hidrogénperoxid bomlását az alábbi egyenletnek megfelelően katalizálja: 2 H2 0 2 peroxidáz 2 H 2 0 + 0 2 Minőségi jellemzőjeként specifikus aktivitását (milligramja egy perc alatt hány mikromól peroxidot képes elbontani) és az RZ (Reinheitszahl: E403 nmE 2 75 nm) értéket szokás megadni. A nemzetközi finomvegyszer-kereskedelemben általában RZ 0,3-tól RZ 3,0-ig terjedő tisztaságú terméket lehet kapni; e termékek aktivitása 50—400 mikromól peroxid (perc/mg). A peroxidáz felhasználási területe igen széles. Főleg az orvos diagnosztikában, valamint peroxidáz-tartalmú szennyvizek és reaktor hűtővizek tisztítására használják. A peroxidáz enzim iránti kereslet az utóbbi években fokozatos növekedést mutat. A peroxidáz előállítására szolgáló ismert eljárások torma- vagy feketeretek-gyökérből indulnak ki; a gyökeret duzzasztás után aprítják, majd 10 15 20 25 30 vizes extrakcióval oldják ki a vízoldható fehérjéket. Az extraktumból a növényi maradékot centrifugálással vagy szűréssel távolítják el. Az így kapott nagy térfogatú fehérjeoldatból ammóniumszulfáttal kisózzák a peroxidáz-tartalmú frakciót, így az 50—80%-os telítési értékek között kicsapódó fehérjék távolíthatók el. Ezután desztillált vizes, hosszú ideig tartó dialízissel a fehérjeoldatot megtisztítják a szervetlen sóktól, majd etanollal vagy acetonnal frakcionáltan kicsapják a nyers peroxidázt. Ebből a nyers termékből kalciumfoszfát-géles adszorpcióval, majd preparatív gélelektroforézissel nyerik ki a tiszta enzimet. Ennek az ismert eljárásnak (S. P. Colowick és N. 0. Kaplan: „Methods in Enzimology", II. kötet 801. oldal /1955,/ Acad, Press. New York) számos hátránya van, amelyek közül a legjelentősebbek a következők: a) Kiindulási anyaga kizárólag intakt növényi termék. b) Az ammóniumszulfátos kisózás — tekintve az igen nagy térfogatokat (nyers gyökérre számítva 10-szeres extraktum-tórfogat) — nagy anyagigényű (a 80%-os telítés szobahőmérsékleten literenként mintegy 0,7 kg ammóniumszulfátot igényel). c) A kisózott fehérje-frakció — nagy sótartalma következtében — csak nagyon hosszú ideig (8— 10 nap) tartó folyamatos dialízissel sómentesíthető. 165727 1
