163467. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus aktivitású proteáz izolálására
MAGYAR SZABADALMI 163467 NÉPKÖZTÁRSASÁG í\rr- . LEÍRÁS á ljjk Bejelentés napja: 1970. VI. 08. (AE—320) Nemzetközi osztályozás: C 07 g 7/028 ipp Német Demokratikus Köztársaság-beli elsőbbsége: 1969. VI. 09. (WP 6a/140 363) ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI Közzététel napja: 1973. IV. 28. HIVATAL Megjelent: 1976. III. 31. Feltalálók: Töpper Horst oki. vegyész, Piesche Klaus oki. biológus, Dr. Schafer Gerhardt oki. vegyész, Radebeul, Német Demokratikus Köztársaság. Tulajdonos: VEB ARZNEIMITTELWERK Dresden, Radebeul, Német Demokratikus Köztársaság. Eljárás fibrinolitikus aktivitású proteáz izolálására í A találmány tárgya eljárás fibrinolitikus aktivitású proteáznak igen tiszta formában történő izolálására. A streptokináz alkalmazása mellett egyre több kísérletet végeznek abból a célból, hogy a trombolitikus terápiát fibrinoldó hatású proteolitikus enzimek fel- 5 használásával bővítsék. Az ilyen proteázoknak már igen csekély mennyisége képes az artériás és vénás vérrögöket feloldani. A terápiásán használható proteáznak igen nagy tisztaságúnak és fiziológiás körülmények mellett toxikus mellékhatások nélkül fibrinolitikusan 10 aktívnak kell lennie. Ismeretes, hogy bizonyos penészgombák fibrinoldó aktivitással rendelkező proteázokat is tartalmazó proteolitikus enzim-keveréket képeznek. 15 Ugyancsak ismeretes, hogy az Aspergillus oryzae-ből Aspergillin 0 néven fibrinolitikus proteáz izolálható [Proc. Soc. exp. Bioi. N. Y., 99, 504 (1958)]. A proteázt a tenyészetek szűrleteiből közvetlenül, vagy IRA 400 műgyantaioncserélőn végzett előzetes tisztítás után 20 szerves oldószerekkel kicsapva dúsítják. Ezt követően a kapott csapadékokat újra szuszpendálják, szűrik és a ballasztanyagokat réz-, cink-, illetve kadmiumszulfát hozzáadásával kicsapják. A hatóanyagtartalmú folyadékot dialízis után liofilizálják [Láncét 2, 443 (1959)]. 25 A. P. Truant és F. G. Norstrom (3 256 157 sz. USA- beli szabadalmi leírás) Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus vagy Absidia coerulea fermentálásával fibrinolitikus aktivitású proteázt állítanak elő oly módon, hogy a tenyészet szűrletét 0 C°-on kétszeres térfogatú; — 20 C°- 30 '163467 ra lehűtött etanollal elegyítik és a kivált aktív anyagot leszívatják, vagy a tenyészet szűrletét tanninoldattal elegyítik és a hatóanyagtartalmú csapadékot 48 óra állás után +4 C°-on acetonnal keverik, amikor az acetonban oldhatatlan hatóanyag visszamarad. Ezt követően a vákuumban szárított hatóanyagot vízben szuszpendálják, az oldhatatlan részt kicentrifugálják és a hatóanyagtartalmú oldatot dialízis után liofilizálják. A 671 648 sz. kanadai szabadalmi leírás eljárást ismertet nagyaktivitású fibrinolitikus szerek előállítására Aspergillus oryzae felhasználásával oly módon, hogy a nyers preparátumot vízben oldják, az oldat pH-értékét sósavval 3,5—5,5-re beállítják, majd térhálósított Dextran Sephadex G—50-en kromatografálják és sósavas vízzel végzett előhívás után a hatóanyagtartalmú frakciókat liofilizálják. B. A. Kudrjaschov [Bér. d. Akad. d. Wiss. dér UdSSR 153.4,939 (1936)] azt találta, hogy az Aspergillus oryzae-n kívül az Aspergillus awamori is tartalmaz egy fibrinolitikus hatású anyagot, melyet Stefanini fentemlített módszerével (Proc. Soc. exp. Biol., N. Y. 99, 504 (1958)] izolált. A. A. Imschenetzki és tsai [Bér. d. Akad. d. Wiss. dér UdSSR 163, 3,737 (1965)] eljárást ismertetnek fibrinolitikus hatású proteáz előállítására Aspergillus terricola-ból, amely szerint a hatóanyagot a tenyészet szűrletéből ammóniumszulfát vagy aceton hozzáadásával kicsapják. A csapadékot centrifugálják, vízben oldják, az oldhatatlan részeket kiszűrik és a szűrletet az ammóniumszulfát és a pigmentek elkülönítése céljából 1
