162200. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-glutamináz előállítására
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1971. II. 19. (BA—2540) Német Szövetségi Köztársaság-beli elsőbbsége: 1970. II. 20. (P 20 07 792.3) Közzététel napja: 1972. VIII. 28. Megjelent: 1974. X. 31. 162200 Nemzetközi osztályozás: C 07 g 7/028 C 12 d 13/10 Feltalálók: Dr. Bauer Klaus vegyész, Wuppertal-Elberfeld, Dr. Kaufmann Wilfried biokémikus, WuppertalnElberfeld, Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonons: BAYER AKTIENGESELLSCHAFT, Leverkusen, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás L-glutamináz előállítására A természetben nagyon elterjedtek az L-glutamint bontani képes enzimek (L-glutaminhidroláz E C 3. 5. 1. 2.). Emlős állatok szervezetében és különféle mikroorganizmusokban találtak ilyen enzimeket. Az L-glutaminázok kémiai, biológiai és terápiás tulajdonságaira vonatkozó ismereteink még nagyon hiányosak. Különböző készítmények hatásának összehasonlítása céljából végzett in vitro vizsgálatok (az enzimhatás szempontjából optimális pH-érték mérése, ionokkal való aktiválás) az irodalomban található eredményei alapján arra lehetett következtetni, hogy az L-glutaiminázok különféle fehérjék. A különböző glutaminázok kémiai vizsgálatokkal való egzakt összehasonlítására azonban nem kerülhetett sor, mert az eddig előállított készítmények mennyisége és minősége nem volt megfelelő [Lásd: Arch. Biochem. Biophys. 108, 143—149. o. (1964)]. Szerzők megkísérelték a baktériumok (Pseudomonas GG 13) által termelt L-glutaminázt dúsítani és stabilizálni az enzim daganatgátló hatásának vizsgálata céljából, de nem sikerült az állatkísérletekhez, ill. a klinikai kipróbáláshoz szükséges mennyiségű és minőségű készítményt előállítaniok [Lásd: Arch. Biochem. Biophys. 108, 143—149. o, (1964)] Az alábbiakban röviden ismertetünk néhányat az irodalomban eddig leírt L-glutamináz-előállítási kísérlet közül: a) Ramadan, El Asmar és Greenberg az alábbi összetételű, pH 7,0-re beállított tápoldatban tenyésztettek Pseudomonas GG 13 baktériumokat laboratóriumi méretben, fermentorban, 30 C°-on, levegőztetéssel: 5 0,4% L-glutaminsav 0,4% glukóz 0,4% (NH4 ) 2 S0 4 0,115% K2 HP0 4 0,063% KH2PO4 10 0,014% MgSO/, 0,0006% FeS04 0,0006% MnS04 0,0006% NaCl Literenként 1,5 mg volt a sejttömeg koncent-15 rációja (száraz sejttömegre számolva), amikor a sejttömeget lecentrifugálták és —15 C°-on fagyasztották. L-glutamináz előállítása céljából 500 g fagyasztott sejttömeget ultrahanggal való feltárás után extraháltak, majd lecentrifugáltak. 20 A felülúszó oldatból extrahálással és kicsapással eltávolították az inert kísérőanyagokat, majd ammóniumszulfáttal való frakcionált kicsapással és zóna-eleíktroforézissel 41,5 mg dúsított enzimet kaptak, melynek aktivitása 80 E/mg [lásd: 25 Arch. Biochem. Biophys. 108,143—149. o, (1964)]. b) Hartmann peptont, élesztőkivonatot, glukózt és szervetlen sókat tartalmazó tápoldatban, 37 C°-on, levegőztetéssel 16 órán át tenyésztett 30 Escherichia coli B bacillust, majd 4540 g fa-162200
