160058. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz EC2 előállítására
MAGTAR SZABADAIMI 160058 NÉPKÖZTÁRSASÁG LEÍRÁS SZOLGÁLATI TALÄLMÄNY adkm*. Nemzetközi osztályozás: 9 Bejelentés napja: 1968. VIII. 14. (BI—311) C 12 d 13/10; C 07 g 7/028 ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL Közzététel napja: 1971. VII. 29. Megjelent: 1973. I. 31. Feltalálók: Dr. Nyíri László biokémikus, 2í80 / üt Dr. Zsupán Kálmán oki. vegyész, 14%, Marossy Katalin oki. vegyész, 5%, Menyhárt András technikus, 3%, Dr. Vályi-Nagy Tibor egyetemi tanár, orvos, 20%, Dr. Hernádi Ferenc orvos, 20%, Keresztes Tamás oki. vegyész, 4%, Nosztray Klára oki. vegyész, 4%, Dr. Kiss Sándorné technikus, 2%>, Debrecen Tulajdonos: BiOGiAL Gyógyszergyár, 50%, Debrecen, Debreceni Orvostudományi Egyetem Gyógyszertani Intézete, á0%, Debrecen *. Eljárás L-aszparagináz EC2 előállítására i Mint ismeretes, a leukémia elleni terápiában az évek során számos szerves szintézissel és bioszintézissel előállított vegyületet próbáltak ki (6-merJsaptopurin, prednizon, guanilhidrazon, metotrexat, azaszerin, 5-fluoruracil, ciklofoszt- 5 amid, mitomicin, vinkrisztin) [MARQUART, H.. Arzneimittel Forsch., 18, 1380 (1968.)]. E viszonylag alacsony molekulasúlyú vegyületeken kívül egy enzimfehérje, az L-aszparagináz mutatott kifejezett hatást aktív ILmfoblasztikus, 30 valamint mieloid leukémia ellen. Az L-aszparagináz (L-aszparagin amidohidroláz, E. C. 3.5.1.1.) enzim antileukémiás hatását KIDD, J. G. [(1953) J. Exptl. Med., 98, 583) is tengeri malac szérumában végzett kísérletei alapján tételezték fel BROOME, J. D. [(1981) Nature, 191, 1114)], valamint MASHBURN, L. T, és WRISTON, J. C. Jr. [(1963) Biochem. Biophys. Res. Comm., 12, 50)]. 20 Csirkemájból izolált L-aszparagináz enzimfehérje szelektív antileukémiás hatása az eredeti elképzeléseket megerősítette. Az enzimfehérje nagyobb mennyiségben való alkalma- 25 zásához szükséges terápiás kísérletek elvégzései: azonban a fehérje növényi, illetve állati szervekből történő előállításával kapcsolatos technikai nehézségek gátolták. 1967-ben vált ismeretessé az enzimíehérje komplexum mikroorga- •,$ nizmusokban való előfordulása, különös tekintettel élesztőkre és baktériumo'kra. Ezirányú vizsgálatainkban megállapítottuk, hogy az L-aszpáragináz enzimkomplex az E. coli B mutáns törzsében több járulékos enzimmel együtt fordul elő; az ezektől való megtisztítás ipari előállítás esetén fokozott műszaki nehézséget jelent. Kutatásaink során sikerült olyan Escherichia coli mutánst izolálnunk, melynek sejtjei folyékony alámerített tenyészközegfoen való tenyésztéskor L-aszparagináz enzimfehérje komplexet viszonylag nagy koncentrációban bioszintetizálnak. Az enzimíehérje nagy tisztaságban történő előállítását lehetővé tette az Escherichia coli mutáns sejtjeinek tenyésztése során tett azon felismerésünk, hogy a tenyészlé pH-jának lúgos tartományba való emelkedése az L-aszparagináz fehérjekomplex antileükémiás hatásáért felelős EC2 jelzésű összetevő koncentráció növekedését eredményezi. A tenyészlé pH-jának növekedése elérhető, ha a sejteket aminosavakban dús és szénhidrátszegény táptalajon alámerített kultúrában, intenzív szellőztetéssel tenyésztjük. Az ezen tenyésztési műveletek hatására intracellulárisan feldúsult EC2 enzimfehérje az általánosan ismert sejtfeltárási eljárásokkal a sejtből kiszabadítható és fehérje kinyerési eljárásokkal izolálható. További előnyként jelentke-160Q58
