159839. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz dúsítására

MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1968. XII.27. (BA-2152) Elsőbbsége: Német Szövetségi Köztársaság, 1967.XII.27. (P 16 42 615.6) 1968. IV.6. (P 17 67 158.8) (P 17 67 157.7) 1968. V.6. (P 17 67 389.1) 1968. VII. 16. (Pl 7 92 043.3) Közzététel napja: 1971. VIII.8. Megjelent: 1977. V.16. 159839 Nemzetközi osztályozás: C 07 g 7/028 Feltaláló: dr. Wagner Otto, vegyész, dr. Bauer Klaus, vegyész, Wuppertal-Elberfeld, dr. Kaufmann Wilfried, biokémikus, Wuppertal-Vohwinkel, dr. Rauenbusch Erich, vegyész, dr. Arens Alfred, vegyész, dr. Irion Eckart, vegyész, Wuppertal-Elberfeld, Német Szövetségi Köz-Tulajdonos: Farbenfabriken Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen, Német Szövetségi Köztársaság -x-Eljárás L- aszparagináz dúsítására Az L-aszparagináz többé-kevésbé nyers enzinpreparátum formájában ismeretes. Ezt az enzim-kémiában szokásos módszerrel állati vagy növényi anyagokból extrahálással, majd dúsítással kapják. Az enzim az L-aszparaginban levő amidkötést bontja, amikoris L-aszparaginsav és ammónia keletkezik. Az ammónia Nessler-reagens segítségével kolorimetriásan meghatározható és ez az L-aszparagináz meghatározására is alkalmas mérési módszer (1. Cancer Research 26,. 2213-17/1966). Az L-aszparagináz-egység még nincs teljesen egyértelműen definiálva így szükséges megállapítani, hogy azt az alábbiak szerint értelmezzük: egy egység (30 perces egység) az az L-aszparagináz mennyiség, amely 37 C° hőmérsékleten, 7,2 pH-érték mellett L-aszparaginból 30 perc alatt egy mikro-mól ammóniát hasít le. Az irodalomból megállapíthatóan az eddig leírt L-aszparagináz-preparátumok maximálisan kb. 1000 egység/mg aktivitásúak (1. Biochemistry 6,721/1967). Az előállítás többek között E. coli sejtekből történik, amelyekből az enzimet ultrahangos kezeléssel felszabadítják és a nyers oldatot ammóniumszulfáttal részlegesen telítik. Ennek során az enzim kisózódik és az enzim-kémiában szokásos oszlopkromatográfiás módszerrel tovább dúsítható. Az L-aszparagináz injekció formájában hatásos olyan daganatok ellen, amelyek növekedéséhez L-aszparagin szükséges. Egyre növekvő mennyiségben alkalmazzák kliniksüdg, anélkül, hogy ezideig lehetséges lenne a szükséges 10 15 20 25 30 mennyiségben rendelkezésre bocsátani (v.ö.Proc. N.A.S. 56, 1516-19/1966). A rosszindulatú daganatok elleni küzdelemben az L-aszparagináz gyógyászati jelentősége erősen megnőtt. Azt találtuk, hogy az L-aszparagináz dúsítható, ill. kristályos L-aszparagináz nyerhető, ha a találmány szerint előnyösen a pirogének leválasztása után a nyers, vizes L-aszparagináz oldatot, amelyhez adott esetben karbamidot vagy más olyan amidot adagolnak, amely a hidrogénhid kötéseket bontja, polialkilénglikollal elegyítjük és az így kapott, L-aszparaginázt tartalmazó csapadékot különválasztjuk, adott esetben tovább tisztítjuk. Amennyiben csak a nyers, vizes L-aszparagináz oldatban állítunk elő csapadékot polialMlénglikol segítségével és ezt önmagában ismert módon választjuk le, akkor a találmány szerinti eljárás során úgy járunk el, hogy a nyers enzim-oldatot, amely 1—30%, előnyösen 1-10% L-aszparaginázt tartalmaz, polialkilénglikol, előnyösen polietilénglikol vizes oldatával elegyítjük. Ez esetben a kicsapó oldat optimális etilénglikol koncentrációja 40-60%, de lényegesen kisebb koncentrációjú oldatok is alkalmazhatók. A felhasznált polietilénglikol optimális molekulasúlya 1000 és 5000 között van. A kisebb vagy nagyobb molekulasúlyú anyagok kevésbé alkalmasak. A megadott vizes polietilénglikol oldatot olyan mennyiségben adagoljuk, hogy a polietilénglikol-végkoncentráció 15-40%, előnyösen 18-30% legyen. A képződött üledéket elválasztjuk, 159839