146518. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trichothecin előállítására
O Megjelent: 1960. április 1. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 146.518. SZÁM 12. p. 11—17. OSZTÁLY — JO—87. ALAPSZÁM Eljárás trichothecin előállítására Dr. Johan Béla orvos, és dr. Szabó Istvánné, gyógyszerész, Budapest A bejelentés napja: 1958. szeptember 23. A trichothecin antibiotikumot Trichothecium roseum tenyészetekkel végzett fermentációkkal állítják elő. Az irodalmi adatok szerint a fermentátumban elért maximális trichothecin érték 40— 50 gamma, legjobb esetben 100 gamma/ml volt. Ügy találtuk, hogy a trichothecin hozamot lényegesen növelhetjük, ha a Trichothecium roseummal történő fermentálást PeniciUium sp., különösen az általunk PeniciUiuim P2J vel jelzett törzs jelenlétében végezzük, melyet az Országos Közegészségügyi Intézet törzsgyűjteményébe 1958. szeptember 8-án „a—13" szám alatt letétbe helyeztünk. Ügy találtuk, hogy a trichothecin hozam szempontjából lényeges szerepet játszik a PeniciUium törzsnek a Trichothecium fermentációra történő Kioltásának időpontja. Általában úgy találtuk, hogy a ráoltás legelőnyösebb időpontja a fermentálás kezdetétől számított 24 óra. Ugyancsak lényeges szerepet játszik a ráoltott PeniciUium tenyészet mennyisége is. A ráoltott PeniciUium tenyészet mennyiségével eleinte arányosan nő a trichothecin hozam, azonban egy bizonyos mennyiségnél a trichothecin hozam hirtelen csökken, ill. a trichothecin termelése hirtelen meg is szűnik. Azt a PeniciUium tenyészet mennyiséget, amely a trichothecin-tenmelést megszünteti, nevezzük a továbbiakban kritikus mennyiségnek. Ilyenkor a fermentátumban kevés penicillint mutathatunk ki. Ügy találtuk, hogy a legjobb trichothecin hozamot akkor érjük dl, ha a kritikus mennyiség alatt, de annak közelében levő mennyiségű PeniciUium inoculummal dolgozunk. Ha Trichothecium fermentációra PeniciUiuimot spóra-szuszpenzió formájában oltjuk, úgy a PeniciUium spórákat ugyanakkor kell a fermentációba oltani, amikor ezt a Triohothecium roseum 24 órás vegetatív inoculumával beoltjuk, mert később már kevésbé hatásos vagy teljesen hatástalan. Kísérleteinkben általában a következőképpen jártunk el: 500 ml-es Erlenmeyer-lambikba 100 ml alábbi összetételű táptalajt tettünk és ezt sterileztük. Ammónium tartarát 0,2% Sacharóz 1,0% Élesztőkivonat (száraz anyag) 0,031% Malátakivonat (kb. 50% maltóz) 5,0% Ku'koricalekvár (száraz anyag). 0,1% Ferde agáron tenyésztett jól spórázott Triohothecium roseum tenyészetet 5 ml fiziológiás konyhasó-oldattal lemosva ennek 1 ml-nyi mennyiségével oltjuk a fenti lombikot. 24 órai 26—27 C°-on történő rázott tenyésztés után ebből 2 ml-t oltunk 3 ugyanilyen táptalajú lombikba és ezeket szintén rázógépen 24 lóráig tenyésztjük. Ugyanakkor PeniciUium P2 jelzésű törzs ferde agar tenyészetét nedvesítő anyag, pl. laurinszulfonsavas nátrium (1:8000) vizes oldatának 5 ml-nyi mennyiségével lemossuk és ebből 1 ml-t egy fenti táptalajú lombikba oltunk és rázógépbe helyezzük. 24 óra múlva ezt — a kísérletnek megfelelő mennyiségű — PeniciUium inoculumot ráoltjuk az ekkor már 24 órás Trichothecium tenyészetre. Ugyanakkor csak Trichotheciummal, ill. csak Penicilliummal kontroll lombikokat is oltunk. Az első trichothecin ill. penicillin érték-meghatározást 64 óra múlva végezzük. Megemlítjük, hogy az összes rázott-lombik kísérleteket mindig 3 párhuzamosan feltett lombikban végeztük, a közölt trichothecin érték — ha csak kifejezetten mást nem mondunk — mindig a 3 párhuzamos lombikban termelt trichothecinnek átlagértéke. Az 500 ml-es Eirlenmeyer-lombikban a táptalaj mennyisége mindig 100 ml volt, A rázógép percenként 320 rotációt végző síkrázógép. Az alábbi kísérletekben a Trichothecium roseummal indított fermentációknak a trichothecin hozam növelése szempontjából történő ráoltásához főleg a PeniciUium P2 törzset használtuk, de használtunk egyéb, a penicillin-termelésnél használatos törzseket, mint pl. a Wis. Q-—176 törzset is, A ráfertőzés időpontja fontosságát az alábbi kísérletek világítják meg. Tiszta Trichothecium roseum tenyészettel oltott rázott lombikokban a fermentálás 72-ik órájában talált trichothecin átlag
