146307. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta 1,4 -androsztadiéndion előállítására
o Megjelent: 1960. március 15. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 146.307. SZÁM 12. p. 11—17. OSZTÁLY - GO-630. ALAPSZÁM SZOLGALATI TALÁLMÁNY Eljárás ^1,4 -androsztadiéndion előállítására Gyógyszeripari Kutató Intézet, Budapest Feltalálók: dr. Wix György (66%), Albrecht Károly (34»/0 ) A bejelentés napja: 1958. június 26. A hasznos termékek izolálása fermentátumokból igen nehéz és költséges eljárást igényel, ha az izolálandó anyag a fermentleben alacsony koncentrációban van jelen. Éppen ezért igen fontosak azok a törekvések, amelyek arra irányulnak, hogy a fermentációt minél töményebb oldatokban lehessen lefolytatni. Ezek a törekvések azonban rendszerint akadályokba ütköznek, miután a szubsztrátum magas koncentrációja többnyire gátolja az átalakítást. Kísérleteink szerint pl. a /l1» 4 -androsztadiéndion Fusarium caucasicum segítségével elvégzett előállítása különböző kiindulási anyagokból gátolt, ha az átalakítandó szteroid koncentrációja a fermentátumban egy bizonyos (kb. 400 mg/liter) szintet elér. Döntő fontosságú volt az a kísérleti felismerésünk, hogy a gátlásért nem a felszaporodó hasznos termék, hanem a kiindulási szubsztrátum magas koncentrációja a felelős. Ezen felismerés alátámasztására elvégzett kísérleteink során azt a megállapítást tettük, hogy ha folyamatos vagy szakaszos adagolással adjuk a tenyészethez az átalakítandó szteroidot és így biztosítjuk, hogy a mikrobiológiai átalakítás során mindig a gátlási szint alatti koncentrációban legyen a fermentátumban jelen, a hasznos végtermék koncentrációja az eddigi eljárásokból ismeretes (200 mg/liter) sokszorosát, előnyösen 10—15-szörösét éri el a tenyészetben. Felismerésünk nagy fontossággal bír az előállítás kivitelezésének megkönnyítése, a szükséges berendezések jobb kihasználása és a jobb gazdaságosság szempontjából. Találmányunk eljárás zl'^-androsztadiéndion előállítására Fusarium caucasicummal, melyre jellemző, hogy a tenyészetben a fermentálás során folyamatos vagy szakaszos adagolással az átalakítandó J4-3-ketoszteroidok koncentrációját 400 mg/ liter alatt tartjuk. Eljárásunk kivitelezését a következő példák szemléltetik: 1. példa: Ferdeagar tenyészetről készült Fusarium 1 caucasicum spóraszuszpenzióval beoltottunk 31 db 50Ó-as Erlenmeyer-lombikot, amelyek 100—100 ml steril Richard-féle táptalajt tartalmaztak. A lombikokat 28°-on inkubáltuk 200-as fordulatszámmal mozgó rázóasztalon. A három lombikban kinőtt tenyészetet összeöntöttük és steril feltételek mellett beoltottunk velük 5 liter iSteril F-jelű táptalajt üvegfermentorban. F-táptalaj összetétele: 0,25 g glükóz 30,00 g kukoricalekvár 75,00 g pepton 5 literre feltöltve csapvízzel pH 6,5-re állítva sterilezés előtt. A tenyészetet 28°-on keverés és levegőztetés közben inkubáltuk és 24 óra múlva adagoltunk hozzá 1 g /f4 -androszténdiont 25 ml acetonban feloldva. 2 óra múlva, mikor az átalakítás már megindult (kvantitatív Kober—Haenni reakcióval mértük a keletkezett androsztadiéndion mennyiségét) 10 percenként 200—200 mg androszténdiont folyattunk a fermentátumhoz, míg a beadagolt szteroid összmennyisége el nem érte az 5 g-ot. Az átalakítással abban az időpontban (7. óra) álltunk le, mikor a kvantitatív mérés 4,4 g androsztadiéndion jelenlétét mutatta a fermentátumban. Ekkor a micéliumot szeparáltuk a fermentlétől, a micéliumot 3-szor mostuk kétszeres térfogat csapvízzel, a mosóvizet egyesítettük a fermentlével és az így kapott oldatot extraháltuk kétszer 1/6 térfogat diklóretánnal 40 C°-on. A mosott micélium acetonnal és diklóretánnal mosva nem adott le több androsztadiéndiont. Az extraktumot 2%-os nátriumhidrokarbonáttal, majd vízzel mostuk, nátriumszulfáttal szárítottuk, bepároltuk. Az olajos maradékból hűtőszobában való állás közben kivált kristálytömeget kiszűrtük és petrol-
