144632. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szérumfehérjék frakcionálására

O Megjelent: 1958. november 15-én. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 144.632. SZÁM 12. p. 11—17. OSZTÁLY — Rí—147. ALAPSZÁM Eljárás szérumfehérjék frakcionálására A Magyar Állam, mint a feltalálók: Dr Richter János és dr. Richter Péter budapesti lakosok jogutódja A bejelentés napja: 1955. július 16. Ismeretes, hogy szérumfehérjéket elektroforézisen kívül általában olymódon lehet frakcionálni, hogy növelik, vagy csökkentik az oldat elektrolit tartalmát, vagypedig organikus oldószerek fokozatos hozzáadásával csapják ki egymás után a különböző komponenseket. E három utóbbi módszerre jellemző az, hogy az egyes fehérje komponensek az elektroforetikusan leglassabban mozgó gamma globulinnak kezdve fokozatosan válnak ki, tehát legutoljára az albumin különíthető el az oldatból. Azt találtuk, hogy a szérumfehérjék frakcionálását el lehet végezni kvaterner ammonium vegyülettel, előnyösen cetilpiridiniumbromiddal vagy cetilpiridiniumkloriddal is, amikor a fentemlített három módszerrel ellentétben nem a lassan vándorló gamma-globulínnal, hanem a leggyorsabban vándorjó albuminnal kezdve válnak le fokozatosan az egyes fehérje frakciók attól függően, hogy a kicsapószer koncentrációját miként növeljük. Ilyen módon azonban nem csak arra van lehetőségünk, hogy a szétválasztást a fehérjespektrum ellenkező oldaláról kezdve végezhetjük el, hanem valamelyik alkalmas, ismert eljárással, pl. az ioncserélő módszerrel kombinálva bármely frakciót izolálhatunk olymódon, hogy oldatban tartjuk a megfelelő fehérjét, míg a többieket kicsapjuk. Így az elkülöníteni kívánt fehérjét megóvjuk attól, hogy azt szintén kicsapva esetleg részlegesen denaturáljuk. A fehérje frakciók leválasztására szolgáló anyag lehet analitikai tisztaságú cetilpiridiniumbromid vagy klorid, de a célnak megfelel a kb. 35%-os technikai minőségű cetilpiridiniumbromid oldat is. A kvaterner ammoniumvegyület hatására keletkezett csapadék denaturált fehérje, melynek szérumfehérjék esetén az izoelektromos pontja pH 7,2—9,8 között változik aszerint, amint albuminról, ill. alfa, beta és gamma globulinról van szó. A kicsapás folyamán a pH érték betartása az eredmény szempontjából igen fontos, tekintettel arra, hogy híg sav, híg lúg, ill. töményebb sóoldat a csapadékot oldja. Ügyelni kell továbbá a kiindulási anyag fehérjekoncentrációjára is, mivel töményebb fehérje koncentráció is gátolja a csapadék kiválását. Példa: 30 ml nem konzervált friss hiperimmun lószérumot hígítottunk 60 ml desztillált vízzel, hozzáadtunk 1 ml 35%-os technikai cetilpiridiniumbromidot (kereskedelmi néven: Nitrogenolt) és a pH értéket 8,6-ra állítottuk be. Az elegy y2

órát állt 40— 42 C°-on, majd lecentrifugáltuk. A szupernatans oldathoz újabb 0,5 ml, majd 0,4 ml 35%-os cetilpiridiniumbromidot adtunk és V2 órán keresztül 40 C°-on tartottuk és centrifugáltuk. A kvaterner ammonium só először az albumint, majd az alfa és beta globulint csapja ki. 2. 30 ml szérumhoz adunk 60 ml desztillált vizet, az oldat pH értéke 2,6 specifikus vezetőképessége =4,100 mho. Erősen savas kationcserélő és erősen bázikus anioncserélő műgyanta elegyével az oldatot kevertük mindaddig, míg a specifikus vezetőképessége=77 mho és pH értéke 5,2 lett. Ekkor a gamma és beta globulin levált. Az oldatot centrifugáltuk, a pH értéket 8,6-ra állítottuk be és 0,5 ml 35%-os cetilpiridiniumbromidot hozzáadva V2 órán át 40 C°-on tartottuk, majd ismét centrifugáltuk. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás szérumfehérjék frakcionált kicsapására, melyre jellemző, hogy kicsapó szerként vizes közegben kvaterner ammonium vegyületet, célszerűen cetilpiridiniumbromidot és/vagy kloridot használunk 7—10 pH tartományban 40—45 C°-on. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a kicsapószer koncentrációját az oldatban fokozatosan növeljük. 3. Az 1., 2. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a frakcionálási ioncserélős eljárással kombinálva foganatosítjuk. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója !078. Terv Nyomda, 1958. — Felelős vezető: Gajda László